Wektorowy transfer genów. Wektory adenowirusowe w inżynierii genetycznej

• 1. Wektory oparte na retrowirusach;
• 2. Wektory oparte na wirusach HIV (lentiwirusach);
• 3. Wektory oparte na adenowirusach;
• 4. Wektory oparte na wirusach związanych z adenowirusami;
• 5. Wektory oparte na wirusach opryszczki.

Wektory oparte na retrowirusach

Są to wirusy o małym RNA, które mogą infekować jedynie dzielące się komórki, w których się rozmnażają. Genom wirusa (w postaci prowirusa) integruje się z DNA komórki docelowej. Dlatego wektory retrowirusowe teoretycznie są w stanie zapewnić długoterminową ekspresję transgenów w niektórych typach komórek. Większość wektorów retrowirusowych pochodzi z wirusa mysiej białaczki Moloneya. Genom wirusa jest modyfikowany w celu uniknięcia ekspresji białek wirusowych w zakażonych komórkach, zapobiegając w ten sposób rozwojowi odpowiedzi immunologicznej przeciwko tym komórkom. Ponieważ wirusy te infekują jedynie dzielące się komórki, wektory retrowirusowe stosuje się głównie do transfekcji komórek ex vivo lub do eksperymentalnego leczenia nowotworów.

Koło życia . Genom retrowirusów składa się z nici dodatniej RNA. Otoczka retrowirusów jest utworzona z błony zakażonej komórki i zawiera białka wirusowe. Do replikacji genomu i składania wirusa potrzebne są trzy geny wirusowe: gag, pol i env. W zakażonej komórce, w wyniku odwrotnej transkrypcji na matrycy wirusowego RNA, powstaje dwuniciowy DNA (prowirus), który następnie integruje się z genomem komórkowym. Zapewniają to białka wirusowe – odwrotna transkryptaza i integraza. Aby prowirus mógł przeniknąć do jądra, konieczne jest zniszczenie błony jądrowej komórki, do czego dochodzi podczas mitozy. Prowirus zintegrowany z genomem komórkowym wykorzystuje aparat komórkowy do transkrypcji wirusowych mRNA, ich przetwarzania i translacji. Cykl życiowy wirusa kończy się syntezą nowego RNA i nici na matrixie prowirusa. Specyficzna sekwencja w cząsteczce RNA (psi) daje sygnał do złożenia, po którym nowe wirusy wyrastają z powierzchni komórki.

Zastosowanie wektora retrowirusowego. A. Schemat otrzymywania wektora retrowirusowego. B. Ekspresja transgenu w komórce docelowej po wprowadzeniu wektora retrowirusowego zawierającego RNA

Opis ryciny 1. A. Schemat otrzymywania wektora retrowirusowego. Aby uzyskać wektory retrowirusowe, które nie są zdolne do reprodukcji, stosuje się specjalne linie komórkowe, które są zdolne do syntezy białek wirusowych, których geny są usuwane podczas konstruowania wektora. Geny gag (G), pol (P) i env (E) wprowadza się do komórek odpowiedniej linii (na przykład ludzkich embrionalnych komórek nerek) przy użyciu plazmidów bakteryjnych. Komórki syntetyzujące odpowiednie białka wirusowe nazywane są komórkami pakującymi. Następnie do transfekcji komórek pakujących stosuje się plazmid zawierający rekombinowany prowirusowy DNA, w którym zamiast genów gag, pol i env zlokalizowany jest pożądany transgen. Komórki zawierają teraz wszystko, co jest potrzebne do złożenia wirusów, a wektory retrowirusowe zaczynają gromadzić się w pożywce hodowlanej. Wektory te zawierają transgen, ale brakuje im wirusowych genów gag, pol i env, w związku z czym nie mogą się rozmnażać podczas infekowania następnej komórki. B. Ekspresja transgenu w komórce docelowej po wprowadzeniu wektora retrowirusowego zawierającego RNA.

Konstrukcja i otrzymywanie wektora. Wektory retrowirusowe pochodzą z odpowiedniego prowirusa. Geny gag, pol i env są usuwane, aby zrobić miejsce dla nowego materiału genetycznego i zapobiec rozmnażaniu się wirusa (ryc. 1). Wektor retrowirusowy może zawierać do 8000 par nukleotydów obcego DNA. Ponieważ rekombinowany wirus nie może syntetyzować wirusowego mRNA, transfekowanym komórkom brakuje syntezy białek wirusowych, które mogłyby wywołać odpowiedź immunologiczną. Wraz z genem przeznaczonym do leczenia do wektora można wprowadzić promotor i wzmacniacz-ser, zapewniając skuteczną ekspresję transgenu, a w niektórych przypadkach jego specyficzność tkankową. Można również zastosować wirusowy promotor i wzmacniacz zlokalizowany w regionie długich powtórzeń końcowych (LTR).

Po usunięciu genów kodujących białka wirusa i zapewniających reprodukcję wirusa, wirus może rozmnażać się jedynie w specjalnie utworzonych liniach komórek pakujących, które syntetyzują te białka (ryc. 1). Geny wirusowe (gag, pol i env) wstawia się do genomu tych komórek, tak aby były one zlokalizowane na różnych chromosomach. Zmniejsza to prawdopodobieństwo ponownego połączenia tych genów z pierwotnym genomem wirusa i stworzenia wirusów zdolnych do reprodukcji. Po wprowadzeniu rekombinowanego prowirusowego DNA do komórek pakujących, te ostatnie zaczynają wytwarzać wektor retrowirusowy. Prowirusowy DNA wprowadza się w postaci plazmidu, w którym mały region genu gag z sygnałem składania i obcymi genami jest zamknięty pomiędzy dwoma długimi powtórzeniami końcowymi. Transfekcję komórek pakujących przeprowadza się standardową metodą. Opracowano kilka modyfikacji tego podejścia, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo rekombinacji w celu utworzenia wirusa zdolnego do reprodukcji.

Komórki docelowe. Zdolność wirusa do selektywnego infekowania określonych typów komórek jest w dużej mierze zdeterminowana przez interakcję między białkiem zewnętrznej otoczki wirusa (w retrowirusach kodowanych przez gen env) a odpowiadającym mu receptorem błony komórkowej. Wirus białaczki mysiej Moloneya jest ekotropowy, co oznacza, że ​​infekuje tylko komórki myszy. Aby poszerzyć zakres komórek docelowych, stosuje się gen env szczepu 4070A mysiego wirusa białaczki. Szczep ten jest amfotropowy i infekuje komórki nie tylko myszy, ale także innych ssaków, w tym człowieka. Pseudotypowanie, czyli pakowanie genomu wirusa w otoczkę zawierającą białka innego wirusa, umożliwia poszerzenie zakresu komórek docelowych. Na przykład, glikoproteina wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej, zwana białkiem G, łatwo włącza się do otoczki wirusa mysiej białaczki Moloneya. Obecność tego białka poszerza zakres komórek docelowych i ułatwia infekcję. Dodatkowo włączenie białka G zwiększa stabilność wektora retrowirusowego i umożliwia uzyskanie wyższego miana wirusów podczas ultrawirowania. Wadą białka G jest jego toksyczność wobec komórek pakujących. Tę wadę można częściowo przezwyciężyć, stosując komórki pakujące z indukowalną ekspresją białka G. Wektory retrowirusowe zawierające inne białka wirusowe, takie jak wirus białaczki gibon lub białka wirusa limfocytowego zapalenia opon i opon mózgowo-rdzeniowych, są mniej toksyczne dla komórek ssaków.

Aplikacja. Za pomocą wektorów retrowirusowych komórki pacjenta zazwyczaj transfekuje się ex vivo lub wektory wprowadza się bezpośrednio do tkanek. Pierwsze podejście polega na wyizolowaniu komórek pacjenta i utrzymaniu ich w hodowli, zainfekowaniu komórek wektorem retrowirusowym, a następnie wstrzyknięciu komórek pacjentowi. W ten sposób próbowali modyfikować limfocyty i hematopoetyczne komórki macierzyste z niedoborem deaminazy adenozyny i rodzinną hipercholesterolemią. Podobną procedurę zastosowano w celu indukowania ekspresji immunomodulatorów w komórkach nowotworowych. Próbowano bezpośredniego wstrzykiwania wektorów retrowirusowych głównie w leczeniu guzów litych.

Bezpieczeństwo. Ponieważ wirus jest wstawiany do genomu komórkowego (co jest ważne dla długoterminowej ekspresji) i losowo, istnieje ryzyko mutacji (mutageneza insercyjna). Na przykład wprowadzenie wirusa może zmienić funkcję genu regulującego podział komórek, co prowadzi do niepożądanych konsekwencji. Retrowirusy zdolne do rozmnażania mają pewną rakotwórczość, ale nie obserwuje się tego w wektorach retrowirusowych pozbawionych tej zdolności.

Spis treści tematu "Biotechnologia. Inżynieria genetyczna. Terapia genowa.":
1. Biotechnologia. Nauka biotechnologia. Etapy rozwoju biotechnologii.
2. Obszary zastosowań biotechnologii. Obszary zastosowań biotechnologii. Optymalizacja procesów mikrobiologicznych w biotechnologii.
3. Przemysłowe wykorzystanie mikroorganizmów. Produkcja produktów syntezy mikrobiologicznej. Produkcja antybiotyków. Produkcja szczepionek.
4. Inżynieria genetyczna. Bezpieczeństwo biologiczne. Znaczenie inżynierii genetycznej. Teoretyczne podstawy inżynierii genetycznej.
5. Organizacja materiału genetycznego w komórce. Genotyp. Co to jest inżynieria genetyczna? Etapy otrzymywania produktów genowych.
6. Zastosowanie metod inżynierii genetycznej. Wskazania (uzasadnienie) stosowania inżynierii genetycznej. Powody stosowania inżynierii genetycznej.
7. Bezpieczeństwo biologiczne w inżynierii genetycznej. Dokumenty regulujące bezpieczeństwo biologiczne.
8. Grupy niebezpieczne mikroorganizmów. Ocena ryzyka stosowania mikroorganizmów genetycznie zmodyfikowanych.
9. Diagnostyka genowa. Terapia genowa. Na czym polega diagnostyka genowa i terapia genowa? Rodzaje terapii genowej.
10. Wektory. Wektory oparte na wirusach RNA. Wektory oparte na genomowych wirusach DNA. Wektory niewirusowe.
11. Perspektywy terapii genowej. Przyszłość terapii genowej. Cele terapii genowej.

Wektory. Wektory oparte na wirusach RNA. Wektory oparte na genomowych wirusach DNA. Wektory niewirusowe.

Jak wspomniano powyżej, do przeniesienia odpowiednich genów do komórki stosuje się różne metody. wektory[z łac. wektor, nośnik]. Głównym problemem w ich rozwoju jest pokonanie bariery immunologicznej biorcy, która chroni organizm przed różnymi wpływami zewnętrznymi, w tym przed wprowadzeniem obcego DNA do genomu komórki. Pod tym względem wirusy cieszą się szczególnym zainteresowaniem, ponieważ ze wszystkich znanych czynników tylko one są zdolne do mniej lub bardziej skutecznej integracji materiału genetycznego z genomem komórek ludzkich. Dlatego też wszystkie wysiłki specjalistów terapii genowej skupiają się obecnie na inżynierii genetycznej wirusów wykorzystywanych jako wektory dostarczające geny terapeutyczne do komórek organizmu pacjenta.

Wektory wirusa RNA

Wirusy genomowe RNAłatwo integruje się z genomem komórki gospodarza, zapewniając w ten sposób długoterminową ekspresję wymaganego genu. Retrowirusy są najbardziej obiecujące w tworzeniu wektorów terapii genowej. Z ich udziałem przeprowadzono około 60% wszystkich prób klinicznych terapii genowej.

Retrowirusy stosunkowo nieszkodliwe dla ludzi, z wyłączeniem oczywiście wirusa HIV i ludzkich wirusów T-limfotropowych. Najczęściej stosowanym wektorem jest wirus białaczki mysiej. Podczas opracowywania wektorów geny kodujące syntezę produktów zapewniających reprodukcję są całkowicie wyłączone z ich składu. Zdolność kodowania transgenów w wektorach retrowirusowych nie przekracza 8000 par zasad kwasu nukleinowego.

Główne problemy aplikacji Wektory wirusowe RNA- efektywne dostarczanie materiału genetycznego do komórek, wspomaganie długotrwałej ekspresji i transdukcji komórek niedzielących się (większość wektorów RNA nie jest w stanie efektywnie przenieść transgenów do komórek spoczynkowych). Jednakże niezdolność retrowirusów do transdukcji komórek spoczynkowych w szczególnej sytuacji może być również korzystna, na przykład w terapii genowej glejaka wielopostaciowego (złośliwego guza mózgu). Ideą ich zastosowania jest selektywna transdukcja dzielących się w obrębie zmiany komórek – komórek nowotworowych i komórek naczyniowych; komórki nerwowe nie dzielą się i dlatego nie służą jako cel dla wektorów retrowirusowych.

Wektory oparte na genomowych wirusach DNA

Wektory, stworzony na podstawie Wirusy DNA Mają duże rozmiary w porównaniu z wirusami genomowymi RNA i dlatego mogą pomieścić fragmenty DNA (transgeny) o długości do 35 000 par zasad.

Wektory adenowirusowe. Tworzy się wektory na bazie adenowirusów do terapii genowej in situ mukowiscydozy i nowotworów złośliwych. Wektory adenowirusowe są zdolne do wysoce wydajnej transdukcji szerokiego zakresu typów komórek ludzkich, w tym komórek niedzielących się. Na szczególną uwagę zasługują wektory oparte na wirusie związanym z adenowirusem. Wirus związany z adenowirusem jest wirusem niepatogennym, szeroko rozpowszechnionym u ludzi (AT do jego Ag występuje u 80% ludzi). Wirus jest tropowy dla określonej części genomu, integruje się głównie z krótkim ramieniem chromosomu 19. Doświadczenia wykazały skuteczność wektorów stworzonych na bazie wirusa towarzyszącego adenowirusowi w transdukcji komórek mózgu, mięśni szkieletowych i wątroba.

Inne wirusy genomowe DNA. Wśród innych wirusów zawierających DNA stosunkowo często stosuje się wirusa opryszczki pospolitej (HSV), który wykazuje tropizm w stosunku do tkanki nerwowej (w związku z czym jest wykorzystywany do transdukcji komórek mózgowych).

Wektory niewirusowe

Wektory niewirusowe(cząsteczki DNA z właściwościami transpozonu lub sekwencji insercyjnej) są mniej powszechne niż wektory wirusowe. Jednakże wektory niewirusowe oferują wiele korzyści, takich jak bezpieczeństwo i łatwość konstrukcji. Konstruując syntetyczny system dostarczania genów do komórek, można uniknąć niebezpieczeństwa wytworzenia rekombinowanego wirusa lub innych skutków toksycznych.

100 RUR bonus za pierwsze zamówienie

Wybierz rodzaj pracy Praca dyplomowa Praca kursowa Streszczenie Praca magisterska Raport z praktyki Artykuł Raport Recenzja Praca testowa Monografia Rozwiązywanie problemów Biznes plan Odpowiedzi na pytania Praca twórcza Esej Rysunek Eseje Tłumaczenie Prezentacje Pisanie na klawiaturze Inne Zwiększanie niepowtarzalności tekstu Praca magisterska Praca laboratoryjna Pomoc on-line

Poznaj cenę

Wektory retrowirusowe

Doświadczenia z badań klinicznych z udziałem ponad 200 pacjentów pokazują, że wektory retrowirusowe z defektem replikacji nie powodują żadnych niepożądanych skutków ubocznych. Niemniej jednak w dalszym ciągu dużą wagę przywiązuje się do bezpieczeństwa ich stosowania. Stworzono konstrukt zwany plazmawirusem, który zawiera geny retrowirusowe knebel I uh pod kontrolą 5"-LTR-npoMOTopa, a także genu „terapeutycznego” i genu środowisko, sterowany przez promotor wirusa cytomegalii. Po transfekcji plazmawirus wyzwala tworzenie cząstek wirusa z defektem replikacji, a prawdopodobieństwo rekombinacji w celu utworzenia retrowirusów kompetentnych pod względem replikacji jest bardzo niskie. Wektor może przenosić nie więcej niż 3,5 kb. DNA, ale także długość większości potencjalnych „terapeutycznych” cDNA i genów supresorowych nowotworu wynosi 0,5–2 kb.

W systemie wektorów retrowirusowych wprowadzono dodatkowe ulepszenia: zwiększono liczbę powstałych cząstek wirusa, zwiększono wydajność transdukcji, przeprowadzono modyfikację inżynierii genetycznej w celu zapewnienia ich penetracji do niedzielących się komórek oraz specyficzność infekcja wzrosła. W tym drugim przypadku genom rekombinowanego wektora retrowirusowego jest pakowany w otoczkę innego wirusa, którego białko określa specyficzność wiązania retrowirusa i zakres zakażanych przez niego komórek. Zjawisko to nazywa się mieszaniem fenotypowym (tworzenie pseudotypu). Wirus mieszany fenotypowo wytwarza się przez kotransfekcję linii komórkowej syntetyzującej produkty genów knebel I pol, rekombinowany wektor retrowirusowy i wektor ekspresji genów śr kolejny wirus. Poprzez zmianę genu środowisko, można albo zawęzić spektrum komórek zakażonych wirusem do ściśle określonego typu, albo je rozszerzyć. Ponadto w genie śr retrowirusa można wstawić sekwencję nukleotydową kodującą peptyd, który wiąże się ze specyficznym receptorem komórkowym i zapewnia wprowadzenie rekombinowanego retrowirusa do pożądanych komórek. Wreszcie, specyficzność ekspresji genów terapeutycznych można osiągnąć pod kontrolą promotora specyficznego dla komórki.

Wektory adenowirusowe

Adenowirusy infekują niedzielące się komórki ludzkie i są szeroko stosowane jako żywe szczepionki, które zapobiegają infekcjom dróg oddechowych i zapaleniu żołądka i jelit, nie powodując przy tym skutków ubocznych. Te właściwości sprawiają, że adenowirusy są obiecujące w dostarczaniu genów do komórek docelowych.

Aby otrzymać wektor adenowirusowy, linię komórkową syntetyzującą produkty genu adenowirusa E1 kotransfekowano dwoma sekcjami genomu adenowirusa (ryc. 21.7). Jeden z nich może występować jako gatasmid w E coli i zamiast regionu E1 zawiera gen „terapeutyczny”, flankowany przez sekwencje nukleotydowe adenowirusa, a druga to cząsteczka DNA adenowirusa pozbawiona regionu 5"-końcowego, w tym regionu El, i ma region nakładający się z plazmid niosący gen terapeutyczny. Rekombinacja pomiędzy dwoma transfekującymi fragmentami DNA w obszarze ich nakładania się prowadzi do przywrócenia pełnej długości genu adenowirusowego, w którym zamiast regionu E1 zlokalizowany jest gen terapeutyczny produkty dostarczane przez komórkę gospodarza inicjują tworzenie cząstek wirusa uwalnianych z komórki w wyniku lizy. W przypadku braku rekombinacji cząsteczki transfekujące DNA o niewystarczającej długości nie mogą zostać upakowane w cząstki wirusa. Prawdopodobieństwo wystąpienia rekombinacji pomiędzy regionem E1 w genomie komórki gospodarza a DNA rekombinowanego adenowirusa w celu wytworzenia wirusów zdolnych do replikacji jest niezwykle niska.

Gdy rekombinowany adenowirus infekuje komórkę docelową, jego DNA dostaje się do jądra, gdzie ulega ekspresji gen „terapeutyczny”. Rekombinowane DNA nie integruje się z chromosomem i utrzymuje się przez krótki czas, dlatego prowadząc terapię genową wektorami adenowirusowymi konieczne jest ich wprowadzanie w określonych odstępach czasu.

Wektory adenowirusowe stosowano w badaniach klinicznych terapii genowej mukowiscydozy.

Do transformacji roślin stosuje się także wektory zbudowane z wirusów roślinnych. Jednak ich wybór jest ograniczony. Dzieje się tak dlatego, że większość wirusów roślinnych ma RNA jako materiał genetyczny, podczas gdy tylko kilka, np. wirus mozaiki kalafiora (CaMV) i wirusy z grupy Gemini, ma DNA jako materiał genetyczny. Wadą wektorów wirusowych jest ograniczona długość wprowadzanych genów (od 200 do 500 pz) i duża specyficzność w stosunku do gatunków roślin. Zatem wirus mozaiki kalafiora można wykorzystać wyłącznie do transformacji roślin należących do rodziny krzyżowych.

Systemy bezwektorowe

Pistolet genowy (ryc. 13.1). Ta metoda nazywa się balistyka biologiczna. Polega na strzelaniu z armaty próżniowej (pistolet genowy) zawiesiny komórek roślinnych, protoplastów i kalusów. Bombardowanie celów roślinnych (tkanek) odbywa się za pomocą cząstek złota lub wolframu (o średnicy 0,6-1,2 mikrona), na które natryskiwane jest obce DNA. Komórki roślinne umieszcza się na specjalnej płytce celofanowej. Cząsteczki metalu przenikają do komórek, pozostawiając w nich DNA. W tym przypadku około 10-15% komórek ulega transformacji, a część z nich regeneruje się w normalne rośliny. Choć proces transformacji jest losowy, dotychczas tą metodą otrzymywano rośliny transgeniczne, głównie jednoliścienne (kukurydza, ryż, pszenica itp.).

Ryż. 13.1.

(Zielke, 2001. – s. 21)

Metoda elektroporacji. Jest to jedna z metod bezpośredniego wprowadzenia DNA do komórki. Komórki roślinne zanurza się w pożywce zawierającej obcy DNA. Przez to medium przepływa prąd elektryczny o napięciu 250-300 V (w ułamku sekundy!). Przez powiększone pory błony jądrowej obcy DNA przenika do jąder i zostaje zawarty w chromosomach.

Metoda mikroiniekcji. Za pomocą mikroigieł (średnica zewnętrzna 2 μm) wprowadza się obcy DNA do jąder komórek przymocowanych do szkła za pomocą polilizyna.

Użycie „agentów ds. fuzji”. Dodatnio naładowane sfery lipidowe ( liposomy), które otaczają wektor DNA, chroniąc go przed działaniem nukleaz. DNA zawarty w liposomach przenika za ich pomocą do komórek roślinnych (mechanizm nie jest dobrze poznany) i zostaje włączony do genomu.