Etap regeneracji i naprawy. Naprawa
Naprawa DNA- to jest jego naprawa, czyli korekta błędów powstałych w strukturze cząsteczki. Słowo „naprawa” pochodzi od angielskiego „naprawa”, tłumaczonego jako „naprawa”, „naprawa” itp.
Błędy w strukturze DNA, które można naprawić, najczęściej oznaczają naruszenie sekwencji nukleotydów - jednostek strukturalnych tworzących każdą nić DNA. Cząsteczka DNA składa się z dwóch nici, komplementarnych względem siebie. Oznacza to, że jeśli w jednym z obwodów nastąpi uszkodzenie, to wykorzystując drugi, nieuszkodzony obwód, możliwe jest przywrócenie uszkodzonego odcinka pierwszego. Ponadto w komórkach eukariotycznych każdy chromosom jest homologiczny, to znaczy zawiera ten sam zestaw genów (ale nie allele). W skrajnych przypadkach, gdy uszkodzony zostanie odcinek obu nici cząsteczki, można go skopiować z homologicznego chromosomu. Również po fazie S cyklu komórkowego, kiedy następuje replikacja (samokopiowanie), każdy chromosom składa się z dwóch identycznych dwuniciowych chromatyd, tj. zasadniczo dwóch identycznych cząsteczek DNA. Można to również wykorzystać do przywrócenia pierwotnej struktury uszkodzonej cząsteczki.
W toku ewolucji wyłoniło się wiele różnych komórkowych mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za naprawę DNA. Są to głównie różne enzymy i ich kompleksy. Niektóre z nich biorą również udział w replikacji. Szczególnie niebezpieczne jest uszkodzenie genów kodujących takie enzymy. Prowadzi to do utraty jednego lub drugiego mechanizmu naprawczego. W tym przypadku w komórkach następuje szybsza kumulacja uszkodzeń i mutacji. Często powoduje to pojawienie się niekontrolowanych podziałów komórek, czyli pojawienie się nowotworów.
Natomiast jeśli uszkodzenie DNA jest szczególnie poważne, wówczas w komórkach zostaje uruchomiony mechanizm samozniszczenia ( apoptoza). Tym samym takie komórki nie mogą się dzielić, co oznacza, że następne pokolenie nie będzie miało znaczących uszkodzeń DNA.
Błędy w budowie DNA mogą pojawiać się na różnych etapach jego istnienia (podczas syntezy, w okresie przed i po syntezie), z różnych powodów (przypadkowo, pod wpływem substancji chemicznie aktywnych, promieniowania itp.). Ponadto zmiany mogą być różne (utrata grupy chemicznej nukleotydu lub dodanie dodatkowego, zastąpienie nukleotydu innym, utworzenie wiązania chemicznego między dwoma sąsiednimi nukleotydami, przerwanie łańcucha, utrata sekcji itp.) . Ze względu na taką różnorodność trudno sklasyfikować mechanizmy naprawcze. Często dzieli się je na te, które zachodzą podczas replikacji, bezpośrednio po replikacji i podczas pozostałej części cyklu życiowego komórki. Poniżej wymieniono najczęściej badane przyczyny zmian w strukturze DNA i metody naprawy.
Należy pamiętać, że nie wszystkie błędy da się skorygować, stosunkowo małe i niekrytyczne mogą zostać przekazane kolejnym pokoleniom komórek i organizmów. Nie można ich nazwać uszkodzeniami, ale raczej mutacjami. Większość mutacji jest szkodliwa, ale te, które są neutralne lub korzystne w danych warunkach środowiskowych, dostarczają materiału do ewolucji. Zatem niedoskonałość mechanizmów naprawy DNA zapewniła różnorodność życia na naszej planecie.
Korekta sekwencji nukleotydów podczas replikacji
Polimerazy DNA wykonują większość pracy podczas replikacji DNA, dodając nukleotyd po nukleotydzie do nowej nici. Oprócz głównej funkcji, wiele polimeraz ma zdolność usuwania ostatniego nukleotydu, który jest nieprawidłowo przyłączony, czyli taki, który nie jest komplementarny do nukleotydu łańcucha matrycowego.
Strukturę chemiczną nukleotydów można nieznacznie modyfikować. Jednocześnie zaczynają się łączyć wiązaniami wodorowymi, a nie ze swoimi komplementarnymi partnerami. Na przykład cytozyna musi wiązać się z guaniną. Ale jego zmieniona forma tworzy wiązania wodorowe z adeniną, z którą powinna być związana tymina.
Kiedy syntetyzowana jest nowa nić DNA, następny nukleotyd jest najpierw wiązany wiązaniami wodorowymi z komplementarną zasadą matrycy. Polimeraza następnie wiąże go z końcem rosnącego łańcucha wiązaniem kowalencyjnym.
Jeśli jednak był to zmodyfikowany nukleotyd, który niewłaściwie związał się z zasadą komplementarną nici macierzystej, wówczas zwykle szybko powraca do swojej pierwotnej formy i staje się niekomplementarny. Wiązania wodorowe zostają zerwane, pozostawiając koniec nowej nici z wolno wiszącym nukleotydem kowalencyjnie związanym z syntetyzowaną nicią.
W tym przypadku polimeraza DNA nie może przyłączyć kolejnego nukleotydu i nie ma innego wyjścia, jak tylko usunąć ten błędny nukleotyd.
Jeśli wiązania wodorowe nie zostaną zerwane, łańcuch będzie nadal rósł poza błędny nukleotyd, a mutacja punktowa będzie się utrzymywać. Można go wyeliminować po replikacji.
Napraw natychmiast po replikacji
Po zsyntetyzowaniu nowej nici DNA pewne kompleksy enzymatyczne rozpoznają źle sparowane zasady. W tym przypadku pojawia się problem określenia nowych i starych łańcuchów cząsteczki DNA. Nowy wyróżnia się brakiem zasad metylowanych, a u eukariontów obecnością tymczasowych przerw. Na podstawie tych cech kompleksy enzymatyczne identyfikują nowo zsyntetyzowany łańcuch. Zatem w przypadku niekomplementarnych par zasad „błądem” jest nukleotyd nowego łańcucha.
Po znalezieniu błędu inne enzymy wycinają cały odcinek DNA zawierający nieprawidłową zasadę, a nie tylko jeden nukleotyd. Następnie polimeraza odbudowuje tę sekcję, a ligaza sieciuje ją z resztą łańcucha. Mechanizm ten, polegający na wycinaniu i ponownej syntezie fragmentu DNA, nazywa się naprawa przez wycięcie(od słowa wycięcie - cięcie, cięcie) jest dość uniwersalne i stosowane w wielu przypadkach naprawy, a nie tylko przy „sprawdzaniu” DNA bezpośrednio po replikacji.
Mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA
DNA organizmu może ulec zmianie nie tylko na skutek błędów podczas replikacji. Komórka żyje, jest narażona na działanie niekorzystnych czynników zewnętrznych, jej wewnętrzne środowisko biochemiczne może się zmieniać, wywołując reakcje szkodliwe dla DNA. W rezultacie materiał genetyczny ulega uszkodzeniu w taki czy inny sposób. W zależności od rodzaju uszkodzenia i jego skali uruchamiane są różne mechanizmy naprawcze, w których biorą udział nieco inne zestawy kompleksów enzymatycznych.
1. Istnieją enzymy, które odwracają zmiany nukleotydów in situ bez usuwania odcinków DNA. Inaczej mówiąc, jeśli w łańcuchu znajdował się nukleotyd zawierający zasadową guaninę (G), która w wyniku reakcji chemicznej przyłączyła grupę metylową i stała się metyloguaniną, to enzym przekształci ją z powrotem w guaninę. Zasadniczo taka naprawa DNA dotyczy przyłączania i odłączania pewnych grup atomów.
2. W przypadku utraty zasad purynowych może nastąpić naprawa przez wycięcie. W przypadku deaminacji i innych zmian strukturalnych zasad, enzymy glikozylazy wycinają tylko uszkodzoną zasadę nukleotydową. I dopiero potem następuje standardowa naprawa poprzez wycięcie.
3. Sekcję wycina się również podczas tworzenia dimerów, gdy dwa sąsiednie nukleotydy są ze sobą połączone. Zazwyczaj takie reakcje zachodzą w wyniku ekspozycji na promienie ultrafioletowe. Tworzenie dimeru powoduje rozbieżność komplementarnych nici DNA w tym i pobliskich obszarach. Tworzy się pęcherzyk, który jest rozpoznawany przez enzymy. Następnie rozpoczyna się naprawa przez wycięcie.
4. Do tak poważnego uszkodzenia cząsteczek DNA dochodzi, gdy struktura obu jego łańcuchów zostaje zakłócona w tym samym miejscu. W tym przypadku, zgodnie z zasadą komplementarności, nie jest już możliwe odtworzenie jednego łańcucha z drugiego. Przykładem takiego uszkodzenia jest rozbicie cząsteczki DNA na dwie części, na przykład w wyniku narażenia na silne promieniowanie radioaktywne.
Jeśli obie nici cząsteczki DNA ulegną uszkodzeniu, na ratunek może przyjść naprawa rekombinacyjna, polegająca na wstawieniu odcinka z chromosomu homologicznego lub chromatydy siostrzanej zamiast uszkodzonej części. W przypadku pęknięcia istnieją również enzymy, które mogą ponownie połączyć uszkodzony fragment DNA. Jednakże niektóre nukleotydy mogą zostać utracone, co z kolei może prowadzić do poważnych mutacji.
Naprawa rekombinacyjna w okresie presyntetycznym cyklu komórkowego może nastąpić tylko pomiędzy homologicznymi chromosomami, ponieważ każdy chromosom w tym okresie składa się tylko z jednej chromatydy. W okresie postsyntetycznym, gdy chromosomy składają się z dwóch identycznych chromatyd, region można pożyczyć od chromatydy siostrzanej.
Należy podkreślić, że chromatydy siostrzane mają początkowo identyczny zestaw alleli (o ile nie doszło do skrzyżowania). Chromosomy homologiczne tego nie robią. Zatem prawdziwa rekombinacja z genetycznego punktu widzenia zachodzi tylko w przypadku wymiany między homologicznymi chromosomami. Chociaż tutaj w obu przypadkach mówimy o rekombinacji.
Rozważmy ten przykład. Załóżmy, że w DNA powstał dimer tyminy, który nie został naprawiony przed replikacją. Podczas procesu replikacji nici pierwotnej cząsteczki DNA rozchodzą się i na każdej z nich budowana jest nowa nić komplementarna. W łańcuchu szablonowym zawierającym dimer tyminy nie można zbudować w tym regionie odcinka nowego łańcucha. W tym momencie po prostu nie ma normalnego wzorca. W wątku potomnym pojawia się przerwa, ale dimer pozostaje w wątku macierzystym. Oznacza to, że ta cząsteczka DNA „nie wie”, jaka jest prawidłowa sekwencja nukleotydów regionu.
Jedynym wyjściem w tym przypadku jest pożyczenie fragmentu DNA z innej chromatydy. Jest niesiony na jednym z jej łańcuchów. Utworzona tutaj szczelina jest zbudowana zgodnie z szablonem łańcucha dopełniającego. Przeniesione miejsce na uszkodzonej cząsteczce wypełnia lukę w łańcuchu potomnym; łańcuch macierzysty będzie nadal zawierał dimer, który można później naprawić.
Zapewnia samokopiowanie materiału genetycznego. Jednocześnie, dzięki zasadzie komplementarności, dokładność dopasowania sekwencji nukleotydowej łańcucha potomnego do łańcucha wzorcowego jest bardzo wysoka. Ponadto DNA jest substancją dość obojętną chemicznie, co zapewnia mu większą stabilność w porównaniu np. z RNA. Jednak to nie wystarczy, ponieważ DNA może nadal zostać uszkodzone przez wpływy zewnętrzne, a błędy mogą wystąpić również na etapie replikacji. Dlatego komórki muszą posiadać mechanizmy korygujące uszkodzenia i błędy syntezy, czyli przeprowadzać Naprawa DNA.
Istnieje szereg mechanizmów naprawczych realizowanych na różnych etapach syntezy DNA, a także w zależności od rodzaju występujących błędów.
Łącznie mechanizmy naprawcze znacznie zmniejszają częstotliwość błędów w cząsteczkach DNA i mają na celu utrzymanie stabilności materiału dziedzicznego. Ponieważ jednak nie wszystkie zmiany w strukturze DNA zostają wyeliminowane, dochodzi do mutacji, dzięki którym na Ziemi powstały różnorodne organizmy żywe.
Eliminacja błędów z polimerazą DNA
Po pierwsze, sama polimeraza DNA, hodując nową nić DNA, sprawdza, czy do rosnącej nici dołączony jest właściwy nukleotyd.
Istnieją zmienione formy zasad azotowych, które mogą wiązać się komplementarnie z nukleotydami matrycowymi. W ten sposób zmieniona forma cytozyny może wiązać się z adeniną. Polimeraza dołączy ten końcowy nukleotyd do rosnącego łańcucha, ale szybko powróci on do swojej normalnej formy - stanie się zwykłą cytozyną. W tym przypadku wiązania wodorowe ulegają zniszczeniu (ponieważ zerwana jest komplementarność), a na końcu powstaje niesparowany nukleotyd, ale kowalencyjnie połączony z syntetyzowanym łańcuchem. Polimeraza nie może dalej wydłużać łańcucha. Sama polimeraza lub enzym z nią związany edycja endonukleazy odciąć ostatni „zły” nukleotyd.
Dzięki temu mechanizmowi samokorekty częstotliwość błędów replikacji zmniejsza się 10-krotnie. Jeżeli dodanie błędnego nukleotydu na etapie syntezy DNA wynosi 10 -5, wówczas aktywność naprawcza polimerazy zmniejsza ich liczbę do 10 -6.
Mechanizmy naprawcze
Polimeraza DNA koryguje niektóre błędy replikacji, ale nie wszystkie. Ponadto zmiany w sekwencji nukleotydów DNA zachodzą również po podwojeniu DNA. W ten sposób następuje utrata zasad purynowych (adenina i guanina) oraz deaminacja cytozyny, przekształcając się w uracyl. Te i inne zmiany zwykle zachodzą pod wpływem pewnych substancji chemicznie aktywnych zawartych w środowisku otaczającym chromosom. Wiele takich związków zakłóca normalne parowanie zasad. Pod wpływem promieniowania ultrafioletowego dwie sąsiadujące ze sobą reszty tyminy mogą tworzyć ze sobą wiązania, pojawiają się dimery tyminy.
Istnieje bezpośrednie zadośćuczynienie, gdy, jeśli to możliwe, pierwotna struktura nukleotydów zostaje przywrócona enzymatycznie, bez wycinania.
Naprawa przez wycięcie
Wycięcie lub naprawa przedreplikacyjna następuje przed następnym cyklem replikacji.
Istnieje klasa enzymów, które wykrywają zmienione sekwencje nukleotydów w jednej z komplementarnych nici DNA. Następnie błędną sekcję usuwa się i zastępuje nowo zsyntetyzowaną. W tym przypadku macierz jest sekcją uzupełniającego „poprawnego” wątku.
Enzymy naprawcze zwykle wykrywają błędy w nowej nici DNA, a nie w matrycy. Istnieje niewielka różnica pomiędzy dwiema nićmi tej samej cząsteczki DNA pod względem stopnia metylacji zasad azotowych. W łańcuchu potomnym pozostaje w tyle za syntezą. Enzymy rozpoznają taki łańcuch i to na nim korygują odcinki, które w taki czy inny sposób nie są komplementarne do odcinków starego łańcucha. Ponadto przerwy w żarniku, który u eukariontów jest syntetyzowany we fragmentach, mogą służyć jako sygnały.
Enzym endonukleaza zdolne do wykrywania utraty zasad purynowych. Enzym ten rozrywa wiązanie fosfoestrowe w miejscu uszkodzenia. Następny jest enzym egzonukleaza, co usuwa sekcję zawierającą błąd. Następnie buduje się dziurę zgodnie z komplementarnością matrycy.
Glikozylazy DNA- cała klasa enzymów rozpoznających uszkodzenia DNA w wyniku deaminacji, alkilacji i innych zmian strukturalnych w jego zasadach. Glikozylazy usuwają zasady, a nie nukleotydy. Następnie odcinki nici DNA bez zasad są naprawiane w taki sam sposób, jak podczas „naprawy” puryn.
Należy zaznaczyć, że deaminacja zasad azotowych może uniemożliwić przywrócenie pierwotnej sekwencji nukleotydowej. Niektóre pary zasad są zastępowane innymi (na przykład C-G zostanie zastąpione przez T-A).
Enzymy usuwające obszary z dimerami tyminy nie rozpoznają pojedynczych błędnych zasad, ale raczej dłuższe odcinki zmienionego DNA. Tutaj również usuwa się część i na jej miejscu syntetyzuje się nową. Ponadto dimery tyminy można eliminować samoistnie pod wpływem światła – tzw lekka naprawa.
Naprawa poreplikacyjna
Jeśli naprawa przedreplikacyjna nie koryguje zmienionych odcinków DNA, wówczas zostają one utrwalone podczas replikacji. Jedna z cząsteczek potomnego DNA będzie zawierać zmiany w obu jej niciach. W nim niektóre pary komplementarnych nukleotydów zostają zastąpione innymi lub pojawiają się przerwy w nowo syntetyzowanym łańcuchu naprzeciw zmienionych odcinków szablonu.
System naprawy poreplikacyjnej jest w stanie rozpoznać takie zmiany w DNA. Na tym etapie naprawa uszkodzeń DNA odbywa się poprzez wymianę fragmentów (tj. rekombinację) pomiędzy dwiema nowymi cząsteczkami DNA, z których jedna zawiera uszkodzenie, a druga nie.
Dzieje się tak w przypadku dimerów tyminy, które nie zostały usunięte w poprzednich etapach. Pomiędzy dwiema sąsiadującymi tyminami występują wiązania kowalencyjne. Z tego powodu nie są w stanie tworzyć wiązań wodorowych z łańcuchem kowalencyjnym. W rezultacie, gdy na łańcuchu matrycowym zawierającym dimer tyminy syntetyzuje się łańcuch potomny, powstaje w nim przerwa. Przerwa ta jest rozpoznawana przez enzymy naprawcze. Jest oczywiste, że ta cząsteczka DNA nie ma prawidłowego przekroju (jedna nić zawiera dimer tyminy, druga dziurę). Dlatego jedynym wyjściem jest pobranie fragmentu DNA ze „zdrowej” cząsteczki, który jest pobierany z nici matrycowej tej cząsteczki DNA. Powstała tu dziura zostaje wypełniona zgodnie z zasadą komplementarności.
systemu SOS
Znaczna część uszkodzeń DNA jest naprawiana za pomocą opisanych mechanizmów naprawy. Jeśli jednak błędów jest za dużo, wówczas zazwyczaj włącza się tzw. system SOS, składający się z własnej grupy enzymów, które mogą wypełniać dziury bez konieczności przestrzegania zasady komplementarności. Dlatego aktywacja systemu SOS często powoduje mutacje.
Jeżeli zmiana w DNA jest zbyt znacząca, replikacja zostaje zablokowana i komórka nie będzie się dzielić.
Naprawa genetyczna- proces eliminacji uszkodzeń genetycznych i przywracania aparatu dziedzicznego zachodzącego w komórkach organizmów żywych pod wpływem specjalnych enzymów. Zdolność komórek do naprawy uszkodzeń genetycznych odkrył po raz pierwszy w 1949 roku amerykański genetyk A. Kellner. Następnie zbadano różne mechanizmy usuwania uszkodzonych obszarów materiału dziedzicznego i odkryto, że regeneracja genetyczna jest nieodłączną cechą wszystkich żywych organizmów. Najwyraźniej zdolność naprawy uszkodzeń genetycznych pojawiła się we wczesnych stadiach rozwoju życia na Ziemi i poprawiła się wraz z ewolucją istot żywych: enzymy naprawcze są obecne u najstarszych przedstawicieli świata roślin i zwierząt. Do chwili obecnej odkryto dużą liczbę wyspecjalizowanych enzymów naprawczych, a także genów (patrz Gene), które kontrolują ich syntezę w komórkach. Udowodniono, że zmiany w tych genach zwiększają wrażliwość organizmu na niekorzystne i szkodliwe czynniki, przyczyniają się do nasilenia zmian dziedzicznych – mutacji (patrz Mutageneza), występowania chorób i przedwczesnego starzenia się. Ustalono, że niektóre dziedziczne choroby człowieka rozwijają się na skutek zaburzeń w syntezie enzymów naprawczych. Szczegółowo zbadano dwie formy naprawy genetycznej – fotoreaktywację i naprawę przez ciemność.
Fotoreaktywacja, czyli przywracanie światła, odkryto w 1949 roku. A. Kellner, badając biologiczne skutki promieniowania w eksperymentach na mikroskopijnych grzybach i bakteriach, odkrył, że komórki wystawione na tę samą dawkę promieniowania ultrafioletowego przeżywają znacznie lepiej, jeśli po naświetlaniu w ciemności, są umieszczane w warunkach normalnego naturalnego światła. Na tej podstawie zasugerowano, że światło eliminuje część uszkodzeń struktur genetycznych komórek, które powstają pod wpływem promieniowania ultrafioletowego.
Prawie dwie dekady zajęło rozszyfrowanie efektu fotoreaktywacji odkrytego przez A. Kellnera. Okazało się, że promieniowanie ultrafioletowe ma zdolność zakłócania struktury cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego (w skrócie DNA - patrz Kwasy nukleinowe), które niosą ze sobą informację genetyczną. Cząsteczka DNA zawiera cztery rodzaje tzw. zasad azotowych: adeninę, guaninę, cytozynę i tyminę – i składa się z dwóch nici skręconych w spiralę. Często w jednym wątku identyczne bazy znajdują się obok siebie. Pod wpływem promieniowania ultrafioletowego w niektórych zasadach azotowych rozrywane są wiązania chemiczne, a jeśli to nastąpi np. w pobliskich zasadach tyminowych, łączą się one ze sobą, tworząc tzw. dimer tyminy. Dimery tyminy w dramatyczny sposób zakłócają strukturę podwójnej helisy DNA, w wyniku czego zmienia się znaczenie zapisu genetycznego, co prowadzi albo do wad dziedzicznych przekazywanych później potomkom, albo do śmierci komórki. Aby „leczyć” i eliminować te uszkodzenia, niektóre komórki posiadają specjalne enzymy zwane enzymami fotoreaktywującymi. Enzymy te potrafią „rozpoznawać” obszary DNA uszkodzone przez promieniowanie ultrafioletowe, przyłączać się do nich i niszczyć wiązania powstałe pomiędzy dwiema tyminami, przywracając pierwotną (normalną) strukturę DNA. Jednak „efekt terapeutyczny” enzymów fotoreaktywujących – rozszczepienie połączonych odcinków cząsteczki DNA i przywrócenie jej pierwotnej, prawidłowej struktury – pojawia się tylko przy udziale energii świetlnej. Odtąd światło pełni rolę czynnika aktywującego te procesy, wywołując reakcję fotoreaktywacji. Jak dotąd pozostaje to jedyny przykład reakcji biochemicznych, w których aktywatorem jest energia świetlna.
Początkowo zdolność do fotoreaktywacji odkryto w mikroorganizmach, później enzymy fotoreaktywujące odkryto w komórkach niektórych ryb, ptaków, płazów, owadów, roślin wyższych i alg. Przez długi czas tego typu naprawy nie można było wykryć u ssaków i ludzi. Dopiero w 1969 roku udowodniono, że komórki zwierząt torbaczy mają zdolność do fotoreaktywacji. Fakt ten tłumaczono osobliwością biologii tych starożytnych mieszkańców Ziemi: uważano, że obecność enzymu fotoreaktywującego u torbaczy ma wyjątkowe znaczenie, ponieważ tylko u nich (wśród innych ssaków) zarodek jest wystawiony na działanie światła słonecznego (w tym promieniowanie ultrafioletowe) w procesie przenoszenia go w torbie matki. Najnowsze badania wskazują na możliwość obecności enzymu fotoreaktywującego w komórkach ludzkiej skóry; Być może dlatego intensywne promieniowanie ultrafioletowe, np. podczas opalania, nie powoduje uszkodzeń aparatu genetycznego człowieka.
Ciemne zadośćuczynienie w odróżnieniu od fotoreaktywacji ma charakter uniwersalny. Eliminuje różne uszkodzenia strukturalne DNA, które pojawiają się w wyniku różnego rodzaju promieniowania i wpływów chemicznych. We wszystkich układach komórkowych i organizmach stwierdzono zdolność do ciemnej naprawy. Zdolność komórek drobnoustrojów do naprawy uszkodzeń genetycznych w ciemności odkryto w 1955 r., ale szczegóły tego procesu zaczęto wyjaśniać dopiero w 1964 r. Okazało się, że mechanizmy naprawy ciemności zasadniczo różnią się od mechanizmu fotoreaktywacji. Pierwsza różnica polega na tym, że jeśli podczas reakcji w świetle enzym fotoreaktywujący rozszczepia fragmenty cząsteczki DNA połączone promieniowaniem ultrafioletowym, to podczas naprawy w ciemności uszkodzone fragmenty cząsteczki DNA są usuwane. Druga różnica związana jest z liczbą „uleczalnych” urazów. Enzym fotoreaktywujący działa tylko przeciwko jednemu rodzajowi uszkodzeń DNA – powstawaniu dimerów tyminy pod wpływem promieniowania ultrafioletowego. Enzymy dokonujące naprawy ciemnej są w stanie eliminować różne uszkodzenia strukturalne DNA, które pojawiają się w wyniku różnych oddziaływań na komórki - zarówno chemicznych, jak i radiacyjnych. W wyniku ciemnej naprawy przeprowadza się swego rodzaju molekularną interwencję „chirurgiczną”: uszkodzone obszary są „wycinane”, a powstałe „luki” są wypełniane poprzez lokalną syntezę lub wymianę odcinków pomiędzy uszkodzoną i nieuszkodzoną nicią DNA, jak w wyniku czego zostaje przywrócona jego pierwotna, normalna struktura. Ciemna naprawa odbywa się pod kontrolą dużej liczby enzymów, z których każdy odpowiada za pewien etap tego złożonego procesu. Szczegółowo zbadano dwa rodzaje ciemnej naprawy – wycięcie i postreplikację. W przypadku naprawy przez wycinanie uszkodzony odcinek DNA jest wycinany i zastępowany przed rozpoczęciem kolejnego cyklu reprodukcji komórki, a dokładniej przed rozpoczęciem podwajania (replikacji) cząsteczek DNA. Biologiczne znaczenie tego procesu polega na zapobieganiu utrwalaniu się zmian dziedzicznych (mutacji) u potomstwa i późniejszej reprodukcji zmienionych form. Naprawa przez wycięcie jest najbardziej ekonomiczną i skuteczną formą naprawy genetycznej. Ustalono, że podczas normalnego funkcjonowania w mikroorganizmach aż do 90% istniejących uszkodzeń genetycznych ulega usunięciu przed rozpoczęciem replikacji DNA, a do 70% ulega usunięciu z komórek organizmów wyższych. Naprawa przez wycięcie odbywa się w kilku etapach.
Najpierw specjalny enzym „przecina” jedną z nici DNA, blisko uszkodzonego obszaru, następnie uszkodzony obszar jest całkowicie usuwany, a powstałą „lukę” wypełniają specjalne enzymy (polimerazy DNA), które dostarczają brakujące ogniwa, pożyczając je z nieuszkodzonego pasma. Zdolność do naprawy przez wycinanie została potwierdzona w komórkach mikroorganizmów, roślin wyższych i zwierząt, a także u ludzi.
Naprawa poreplikacyjna- ostatnia szansa dla komórki na wyeliminowanie istniejących uszkodzeń genetycznych i ochronę potomstwa przed zmianami cech dziedzicznych. Jeżeli w DNA występuje tak wiele uszkodzeń, że podczas naprawy przez wycinanie komórka nie ma czasu na ich całkowite wyeliminowanie, lub jeśli uszkodzone są geny decydujące o możliwości naprawy przez wycinanie, to w procesie namnażania (podwajania, replikacji) DNA w nici potomne w miejscu uszkodzenia nici macierzystych tworzą się „luki”. Dzieje się tak dlatego, że enzym odpowiedzialny za replikację DNA (syntezę nici potomnej na nici macierzystej) nie jest w stanie „odczytać” zniekształconej informacji w uszkodzonym miejscu nici macierzystej. Dlatego docierając do uszkodzonego miejsca, które pozostało nieskorygowane podczas naprawy przez wycinanie, enzym ten zatrzymuje się, po czym powoli (z prędkością setki razy wolniejszą niż zwykle) przechodzi przez uszkodzony obszar i wznawia normalną syntezę nici potomnej, oddalając się od tego miejsca . Dzieje się tak we wszystkich punktach, w których nić macierzysta DNA pozostaje uszkodzona na początku replikacji. Oczywiście, jeśli liczba uszkodzeń jest zbyt duża, replikacja zatrzymuje się całkowicie i komórka umiera. Ale komórka nie może istnieć długo z cząsteczkami DNA zawierającymi luki. Dlatego po replikacji, ale przed podziałem komórki rozpoczyna się proces naprawy poreplikacyjnej. Przed podziałem komórki powstają dwie dwuniciowe cząsteczki DNA. Jeśli jedna z nich ma w pewnym miejscu uszkodzenie w jednej nici i przerwę w przeciwnej nici, to w drugiej dwuniciowej cząsteczce DNA obie nici w tym miejscu będą normalne. W tym przypadku może dojść do wymiany odcinków DNA – rekombinacji (patrz: Gen, wymiana genów): z normalnej cząsteczki DNA zostanie wycięty nieuszkodzony odcinek i wstawiony w miejsce uszkodzonego odcinka innej cząsteczki, dzięki czemu uszkodzony materiał genetyczny zostanie zastąpiony normalnym. Po tym, specjalne enzymy (polimerazy DNA) zamkną „luki” (teraz będą w stanie to zrobić, ponieważ w tym miejscu nie będzie uszkodzeń obu cząsteczek), nowo syntetyzowana i stara nić zostaną ze sobą połączone, a Oryginalna struktura DNA będzie wynikiem całkowitego przywrócenia. Zgodnie z charakterem procesu związanego z realizacją rekombinacji, ten rodzaj naprawy poreplikacyjnej nazywany jest także rekombinacją.
Jak widać, opisany mechanizm nie jest jedynym sposobem na przywrócenie prawidłowej struktury DNA po jego podwojeniu (replikacji). W każdym razie znany jest mechanizm, w którym łącza wstawiane są w szczeliny, które nie odpowiadają pierwotnej strukturze naprawianego DNA, czyli zachodzą mutacje. Możliwe, że dzieje się tak w przypadkach, gdy komórka z tego czy innego powodu nie jest w stanie naprawić swojego DNA za pomocą żadnej z opisanych powyżej metod i ma ostatnią szansę – albo przetrwać kosztem mutacji, albo umrzeć. Interakcja różnych systemów naprawczych, regulacja ich aktywności w komórce i dokładny czas działania nie zostały jeszcze dostatecznie zbadane. Stwierdzono, że w niektórych przypadkach w komórce zachodzi skoordynowane działanie enzymów wycinających i naprawy poreplikacyjnej. Przykładowo, jeśli dwie nici DNA zostaną ze sobą połączone (zszyte), co następuje pod wpływem wielu trucizn (na przykład trującej substancji gazu musztardowego), to najpierw rozpoczyna się reakcja naprawy za pomocą enzymu naprawczego przez wycięcie, który tnie jednej nici DNA, a następnie do działania włączają się enzymy naprawy poreplikacyjnej, kończąc proces.
W komórkach ludzkich odkryto układy enzymów naprawy poreplikacyjnej. Nie zostało jeszcze w pełni wyjaśnione, jakie dokładnie mechanizmy enzymatyczne zapewniają tego typu naprawy w komórkach ludzkich, wiadomo jednak, że w komórkach ludzkich może zachodzić rekombinacja i przypadkowe wypełnianie luk wraz z występowaniem mutacji. Niejasna jest również względna skuteczność znanych procesów naprawy genetycznej. Ustalono np., że komórki E. coli napromieniowane światłem ultrafioletowym, pod warunkiem prawidłowego funkcjonowania systemu naprawy przez wycinanie, są w stanie usunąć z DNA aż do 1000 uszkodzeń. Kiedy w DNA pojawia się więcej uszkodzeń, komórka umiera. Jeśli system naprawy przez wycinanie jest wyłączony, wówczas metodą naprawy poreplikacyjnej można usunąć jedynie około 100 zmian. Jeśli oba systemy naprawcze są nieobecne, komórka umiera w wyniku pojedynczego uszkodzenia, które ma miejsce w DNA.
Reparacja i mutacje. Następnie w pierwszych badaniach naprawy genetycznej ustalono ścisły związek między eliminacją uszkodzonych obszarów a zmniejszeniem częstotliwości mutacji. Później udowodniono, że zaburzenia aktywności enzymów naprawczych prowadzą do gwałtownego wzrostu liczby mutacji. Jednocześnie ustalono, że mutacje mogą pojawić się także podczas samych procesów naprawy genetycznej na skutek „błędów” w pracy enzymów naprawczych. Chociaż hipoteza, że procesy naprawcze przebiegają przeważnie bezbłędnie i że dopiero postreplikacyjna reakcja naprawy, w której w szczeliny wbudowują się losowe zasady, powoduje mutacje, zyskała największe uznanie, coraz większa liczba danych eksperymentalnych wskazuje, że nawet stosunkowo niewielka liczba napraw błędów prowadzi do pojawienia się znacznej liczby mutacji, które wykrywane są zarówno w normalnych (naturalnych) warunkach, jak i wtedy, gdy komórki są narażone na działanie czynników uszkadzających.
Reparacja na różnych etapach indywidualnego rozwoju organizmów. Zdolność do przeprowadzenia tego lub innego rodzaju naprawy genetycznej może zmieniać się na różnych etapach rozwoju organizmu. Badania pokazują, że maksymalna efektywność wszelkich procesów naprawczych u ssaków (w tym człowieka) objawia się w momencie rozwoju embrionalnego (wewnątrzmacicznego) oraz w początkowych fazach wzrostu organizmu. Na przykład przez długi czas nie można było znaleźć reakcji naprawy przez wycięcie u gryzoni (chomika, szczura, myszy i innych), a dopiero niedawno odkryto, że tego typu naprawa zachodzi na embrionalnym etapie rozwoju i zatrzymuje się na późniejszych etapach. Często przeprowadza się ją jedynie w dzielących się komórkach, na przykład w rozwijających się komórkach nerwowych zarodka. Jeśli stworzysz warunki, w których podział tych komórek zostanie zahamowany, wówczas wyeliminowana zostanie również naprawa pęknięć jednoniciowego DNA, spowodowanych na przykład promieniowaniem rentgenowskim.
Naprawy zaburzeń i chorób człowieka. W 1968 roku angielski naukowiec D. Cleaver udowodnił, że dziedziczną chorobą człowieka jest xeroderma pigmentosa, której objawami są zaczerwienienie, powstawanie narośli, często ze złośliwym zwyrodnieniem obszarów skóry w miejscu ekspozycji na światło słoneczne, a także zaburzenia widzenia upośledzenie, układ nerwowy i inne, spowodowane defektem aktywności enzymów naprawczych poprzez wycięcie. Później odkryto, że niektóre bardziej dziedziczne choroby ludzkie są spowodowane naruszeniem procesów naprawy genetycznej. Choroby te obejmują zespół Hutchinsona, który powoduje karłowatość, przedwczesne starzenie się i postępującą demencję. Uszkodzenia genów kodujących enzymy naprawcze są odpowiedzialne za pojawienie się szeregu postaci tak stosunkowo powszechnej choroby, jak toczeń rumieniowaty układowy i inne.
Badanie molekularnej natury tych chorób daje nadzieję na stosunkowo szybki rozwój metod ich leczenia. Postęp w tym kierunku zależy zarówno od poznania szczegółów procesów naprawy genetycznej i zbadania możliwości izolowania aktywnie działających enzymów z normalnych organizmów (zwłaszcza drobnoustrojów) i ich późniejszego wprowadzenia do organizmu pacjenta, jak i od metod zastępowania chorych genów zdrowymi ( patrz Inżynieria genetyczna). O ile druga droga pozostaje jedynie w sferze hipotez, o tyle w pierwszym kierunku rozpoczęły się prace eksperymentalne. I tak japońscy badacze K. Tanaka, M. Bekguchi i I. Okada donieśli pod koniec 1975 roku o skutecznym zastosowaniu jednego z enzymów naprawczych wyizolowanych z komórek bakteryjnych zakażonych wirusem bakteryjnym w celu wyeliminowania defektu w komórkach pobranych od pacjenta cierpiącego na z powodu niedoboru pigmentu.xeroderma. Aby enzym ten skutecznie przedostał się do komórek ludzkich hodowanych w sztucznych warunkach, wykorzystano zabity wirus Sendai. Jednak do tej pory takich prac nie przeprowadzono na ludzkim ciele. Inny kierunek wiąże się z rozwojem metod wczesnej diagnostyki chorób wywołanych defektami enzymów naprawczych.
Pomimo dużej dokładności enzymów dokonujących replikacji DNA, a także istnienia mechanizmu korekty, podczas syntezy nowych łańcuchów DNA nadal zdarzają się błędy wynikające z włączenia do ich składu niekomplementarnych nukleotydów. Ponadto cząsteczki DNA w komórkach są narażone na działanie różnorodnych czynników fizycznych i chemicznych, które zakłócają ich strukturę. Do najczęstszych uszkodzeń DNA zalicza się:
Rozerwanie wiązań (b-N)-glikozydowych pomiędzy puryną i deoksyrybozą (depurynacja), co najczęściej wynika z podwyższonej temperatury. W ludzkiej komórce dziennie dokonuje się od 5 000 do 10 000 czynności. oczyszczenie;
Spontaniczna deaminacja reszt cytozyny i adeniny z utworzeniem odpowiednio reszt uracylu i hipoksantyny (około 100 zdarzeń na genom dziennie);
Alkilowanie zasad azotowych pod wpływem środków chemicznych specjalnej klasy ( środki alkilujące);
- wtręt(insercja) niektórych połączeń pomiędzy sąsiednimi parami nukleotydów;
Tworzenie kowalencyjnych wiązań krzyżowych pomiędzy łańcuchami DNA pod wpływem czynników dwufunkcyjnych;
Tworzenie dimerów cyklobutanu (ryc. 2.2) pomiędzy sąsiadującymi pirymidynami w łańcuchu, które następuje pod wpływem absorpcji światła ultrafioletowego (UV).
Większość z wymienionych uszkodzeń zakłóca procesy replikacji i ekspresji genów, np. każdy dimer tyminy w DNA E. coli opóźnia replikację o 10 s. Ponadto zmiany te są źródłem mutacji, jeśli nie zostaną skorygowane przed rozpoczęciem replikacji DNA.
Najczęściej takie naruszenia występują tylko w jednej z nici DNA, podczas gdy druga nić przeciwna uszkodzeniu w większości przypadków zawiera „poprawną” sekwencję, która może służyć jako matryca do korygowania błędów. Zatem podwójna helisa DNA, a także fakt, że koduje ona informację o strukturze enzymów naprawczych, umożliwia unikalny mechanizm korekcji błędów - naprawy, charakterystyczny tylko dla jednej klasy cząsteczek - DNA.
Istnieje wiele systemów i mechanizmów naprawczych występujących w różnych organizmach, wśród nich są takie, które służą wyłącznie naprawie jednego rodzaju uszkodzeń, ale są też mniej specyficzne. Dla wygody wszystkie obecnie znane procesy naprawcze można podzielić na dwie kategorie: 1) te, które nie wymagają udziału replikacji i stanowią bezpośrednią korekcję naruszeń DNA; 2) bardziej złożone procesy, podczas których następuje replikacja naprawy. Najlepiej poznanymi mechanizmami naprawczymi w odniesieniu do naprawy uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem UV są dimery pirymidynowe (ryc. 2.2).
Ponieważ enzymy zależne od światła UV biorą udział w najbardziej znanych procesach naprawy skutków naświetlania UV, mechanizmy naprawcze dzielimy także na jasne (mogą zachodzić jedynie w świetle widzialnym) i ciemne (niewymagające udziału światła widzialnego). światło) naprawa.
Mechanizmy naprawcze do bezpośredniej naprawy uszkodzeń obejmują dealkilację reszt guaniny i monomeryzację dimerów cyklobutanu pomiędzy sąsiadującymi zasadami pirymidynowymi. Dealkilacja reszt metyloguaniny należy do naprawy ciemnej i zachodzi przy udziale enzymów obecnych w komórkach bakterii i substancjach odżywczych. Alkilotransferaza DNA O 6-metyloguaniny katalizuje przeniesienie grup alkilowych do grup sulfhydrylowych reszt cysteinowych enzymu (ryc. 2.3).
W procesie tym następuje rozszczepienie dimerów pomiędzy nukleotydami pirymidynowymi fotoreaktywacja- odbudowa struktury cząsteczek DNA uszkodzonych przez promieniowanie UV w wyniku późniejszej ekspozycji na światło widzialne (naprawa światła). Znana jest nieenzymatyczna fotoreaktywacja krótkofalowa, która polega na monomeryzacji dimerów pod wpływem promieniowania ultrafioletowego o długości fali 240 nm, a także fotoreaktywacja enzymatyczna. To drugie rozumie się zwykle przez samą fotoreaktywację. Proces ten wymaga udziału światła widzialnego o długości fali 300-600 nm i przebiega pod wpływem specyficznych enzymów fotoreaktywujących (fotoliaza deoksyrybopirymidynowa). Substratem fotoliazy są dimery zasad pirymidynowych, z którymi tworzy ona kompleks (enzym nie wiąże się z nienaruszonym DNA). Wykorzystując energię pochłoniętego światła, enzym niszczy dimer, nie rozrywając nici DNA (ryc. 2.4).
Zjawisko fotoreaktywacji jest zjawiskiem powszechnym w przyrodzie i stwierdzono je nawet u tak prymitywnych mikroorganizmów jak mykoplazmy. Enzymy fotoreaktywujące występują w niektórych roślinach wyższych i zwierzętach, a także we wszystkich badanych bakteriach, z wyjątkiem Deinococcus radiodurans, który jest jednak wyjątkowo odporny na działanie światła UV: bakterie te wytrzymują dawki 1000 razy wyższe niż te, które zabić E. coli. Pomimo całkowitego braku zdolności do fotoreaktywacji, D. radiodurans posiada potężny system naprawy przez wycięcie.
Zdarzenia naprawcze związane z wymianą zniekształconych obszarów nie wymagają udziału światła widzialnego i w nich, oprócz innych enzymów, ważną rolę odgrywają dwa rodzaje nukleaz: egzo- i endonukleazy. Egzonukleazy rozcinają DNA zaczynając od końców łańcuchów, a endonukleazy atakują łańcuchy w częściach wewnętrznych, tworząc pęknięcia pojedynczej nici w DNA. Wśród różnorodnych typów napraw związanych z syntezą naprawy DNA można wyróżnić dwa główne: wycięcie I postreplikacyjny naprawa.
Naprawa przez wycięcie. Charakterystyczną cechą naprawy przez wycięcie jest usunięcie uszkodzonego DNA. Ten rodzaj naprawy nie jest tak specyficzny dla uszkodzeń DNA jak fotoreaktywacja i można go zastosować do skorygowania nie tylko dimerów pirymidyny, ale także wielu innych zmian w strukturze DNA. Naprawa przez wycięcie (ryc. 2.5, A) jest procesem wieloetapowym i obejmuje następujące zdarzenia:
1) rozpoznanie uszkodzeń w DNA, które przeprowadzają specyficzne endonukleazy, które wykonują także kolejny etap;
2) przecięcie jednej nici DNA w pobliżu miejsca uszkodzenia - nacięcie(przeprowadzają endonukleazy);
3) usunięcie grupy nukleotydów wraz z uszkodzeniem - wycięcie(przeprowadzać egzonukleazy);
4) Resynteza DNA – wypełnienie powstałej luki (aktywność polimerazy DNA);
5) przywrócenie ciągłości naprawionego łańcucha poprzez utworzenie wiązań kowalencyjnych szkieletu cukrowo-fosforanowego cząsteczki.
Mechanizm naprawy przez wycinanie najlepiej zbadać na przykładzie usuwania w ciemności dimerów pirymidyny z DNA E. coli naświetlanego światłem ultrafioletowym. W komórkach Escherichia coli geny uvrA-D (kodują strukturę enzymów odcinających odcinek łańcucha DNA z dimerem), a także polA (determinują strukturę polimerazy DNA I, która przeprowadza regeneracyjną syntezę DNA), są odpowiedzialne za ten proces. Cechą tej metody naprawy przez wycinanie jest tworzenie jednoniciowych nacięć po obu stronach dimeru tyminy.
W celu naprawy uszkodzeń, w tym związanych z tworzeniem dimerów tyminy, niektóre organizmy stosują inny rodzaj naprawy przez wycinanie, który polega na udziale w tym procesie specjalnego enzymu, N-glikozylazy. W tym przypadku pierwszym zdarzeniem naprawczym jest rozerwanie wiązania glikozydowego pomiędzy uszkodzoną zasadą (na przykład jedną z tymin w dimerze, N-alkilowaną puryną itp.) i dezoksyrybozą. Zatem istnieje lokalny apurinizacja, Lub apirymidynizacja; pojawia się tak zwane miejsce AP, rozpoznawane przez endonukleazę specyficzną dla AP, która rozcina wiązanie fosfodiestrowe obok miejsca AP. Następnie lukę wypełnia się metodą normalnej syntezy naprawczej.
W komórkach bakteryjnych i eukariotycznych odkryto wiele różnych N-glikozylaz. Na przykład glikozylaza DNA uracylu rozpoznaje nieprawidłową parę dG/dU wynikającą ze spontanicznej deaminacji reszty deoksycytozyny z pary dG/dC. Deaminacja cytozyny może prowadzić do pojawienia się podczas replikacji zmutowanej pary nukleotydów dA/dT, gdyż z punktu widzenia tworzenia wiązań wodorowych uracyl zachowuje się podobnie do tyminy. Innym szeroko rozpowszechnionym enzymem tego typu jest N-glikozylaza dimeru pirymidyny, która tworzy miejsce apirymidynowe w naprawie uszkodzeń związanych z tworzeniem się dimerów pirymidyny.
Miejsca, w których nastąpiła depurynizacja lub depirymidynizacja, są rozszczepiane przez endonukleazy AP (apurynowe i apirymidynowe). W komórkach pro- i eukariotycznych występuje wiele różnych endonukleaz AR. Niektóre z nich przecinają nić po stronie 3' miejsca AP, podczas gdy inne przecinają wiązanie diestrowe po stronie 5'; w obu przypadkach powstają końce 3'-hydroksylowe i 5'-fosforylowe. Umożliwia to egzonukleazie usunięcie sąsiadujących reszt po obu stronach nacięcia wraz z uszkodzeniem.
Różne rodzaje naprawy przez wycięcie są szeroko rozpowszechnione u organizmów pro- i eukariotycznych, w tym u ssaków. Zakłócenia w procesach naprawy wycinkowej mogą prowadzić do dramatycznych konsekwencji. Zatem choroba dziedziczna jest znana u ludzi - kserodermia barwnikowa, którego głównymi objawami jest zwiększona wrażliwość na światło słoneczne, prowadząca do rozwoju raka skóry. U tych pacjentów stwierdzono różne wady naprawcze po wycięciu.
Naprawa poreplikacyjna. Ten rodzaj naprawy wymaga udziału produktów genów, które również biorą udział w zdarzeniach rekombinacji (geny rec) i nie jest przeprowadzany w komórkach z mutacją rec, dlatego nazywany jest również naprawą rekombinacyjną. Rekombinacyjna naprawa poreplikacyjna opiera się na procesach replikacji i rekombinacji uszkodzonego DNA i jest najmniej specyficzna ze wszystkich rozważanych rodzajów naprawy, ponieważ nie obejmuje etapu rozpoznania uszkodzenia. Jest to dość szybka metoda odzyskiwania rodzinny Struktury DNA w niciach potomnych (nowo syntetyzowanych): wykazano, że naprawa następuje już w pierwszych minutach po napromienianiu. Cechą tego procesu jest zachowanie uszkodzeń w oryginalnych (macierzystych) łańcuchach (ryc. 2.5, B).
Oprócz szybkości istnieje również powolna naprawa poreplikacyjna, która wymaga kilku godzin. Jest wytwarzany przez układ enzymów, którego nie ma w nienapromienianych komórkach i który jest indukowany przez napromienianie. Mechanizm ten nazywa się naprawą SOS. Zaskakującą różnicą jest znaczny wzrost częstotliwości mutacji, mimo że DNA jest już uszkodzone. Może to być konsekwencją wykorzystania jako matrycy nici DNA zawierającej uszkodzenia.
Naprawa poreplikacyjna zachodzi nie tylko w bakteriach, ale także w komórkach eukariotycznych, w tym u ssaków.
Synteza DNA zachodzi według mechanizmu półkonserwatywnego: każda nić DNA jest kopiowana. Synteza zachodzi etapami. Istnieje system eliminujący błędy w reduplikacji DNA (fotonaprawa, naprawy przedreprodukcyjne i poreprodukcyjne). Proces naprawy jest bardzo długi – do 20 godzin i skomplikowany. Enzymy restrykcyjne wycinają nieodpowiedni fragment DNA i odbudowują go na nowo. Reparacje nigdy nie przebiegają ze 100% skutecznością; gdyby tak było, nie byłoby zmian ewolucyjnych. Mechanizm naprawy opiera się na obecności dwóch komplementarnych łańcuchów w cząsteczce DNA. Zakłócenie sekwencji nukleotydów w jednym z nich wykrywają specyficzne enzymy. Następnie usuwa się odpowiednią sekcję i zastępuje ją nową, syntetyzowaną na drugiej komplementarnej nici DNA. Ten rodzaj zadośćuczynienia nazywa się wycięcie, te. z cięciem. Przeprowadza się go przed kolejnym cyklem replikacji, dlatego jest również nazywany przedreplikacyjny. W przypadku, gdy system naprawy przez wycinanie nie koryguje zmiany, która powstała w jednej nici DNA, podczas replikacji zmiana ta zostaje utrwalona i staje się własnością obu nici DNA. Prowadzi to do zastąpienia jednej pary komplementarnych nukleotydów inną lub do pojawienia się przerw w nowo syntetyzowanym łańcuchu względem zmienionych odcinków. Przywrócenie normalnej struktury DNA może nastąpić również po replikacji. Zadośćuczynienie pooperacyjne przeprowadza się poprzez rekombinację pomiędzy dwiema nowo utworzonymi podwójnymi helisami DNA. Podczas naprawy przedreplikacyjnej i poreplikacyjnej większość uszkodzonej struktury DNA zostaje przywrócona. Jeśli ilość uszkodzeń w komórce, pomimo przeprowadzonej naprawy, pozostaje duża, procesy replikacji DNA w niej zostają zablokowane. Ta komórka nie dzieli się.
19.Gen, jego właściwości. Kod genetyczny, jego właściwości. Struktura i rodzaje RNA. Obróbka, łączenie. Rola RNA w procesie realizacji informacji dziedzicznej.
Gen – odcinek cząsteczki DNA, który niesie informację o strukturze łańcucha polipeptydowego lub makrocząsteczki. Geny na jednym chromosomie są ułożone liniowo, tworząc grupę łączącą. DNA w chromosomie pełni różne funkcje. Istnieją różne sekwencje genów, istnieją sekwencje genów kontrolujące ekspresję genów, replikację itp. Istnieją geny, które zawierają informację o strukturze łańcucha polipeptydowego, a ostatecznie białek strukturalnych. Takie sekwencje nukleotydów o długości jednego genu nazywane są genami strukturalnymi. Geny określające miejsce, czas i czas trwania aktywacji genów strukturalnych są genami regulatorowymi.
Geny są małe, chociaż składają się z tysięcy par nukleotydów. Obecność genu stwierdza się poprzez ujawnienie się cechy genu (produkt końcowy). Ogólny schemat budowy aparatu genetycznego i jego działania zaproponowali w 1961 roku Jacob i Monod. Zaproponowali, że istnieje odcinek cząsteczki DNA z grupą genów strukturalnych. Do tej grupy przylega region składający się z 200 par nukleotydów - promotor (region sąsiadujący z zależną od DNA polimerazą RNA). Region ten sąsiaduje z genem operatora. Nazwa całego systemu to operon. Regulacja odbywa się za pomocą genu regulatorowego. W efekcie białko represorowe wchodzi w interakcję z genem operatora i operon zaczyna działać. Substrat oddziałuje z genem za pomocą regulatorów, a operon zostaje zablokowany. Zasada sprzężenia zwrotnego. Wyrażenie operonu jest włączone jako całość.
U eukariontów nie badano ekspresji genów. Powodem są poważne przeszkody:
Organizacja materiału genetycznego w postaci chromosomów
W organizmach wielokomórkowych komórki są wyspecjalizowane i dlatego niektóre geny są wyłączone.
Obecność białek histonowych, podczas gdy prokarioty mają „nagi” DNA.
DNA jest makrocząsteczką, nie może przedostać się z jądra do cytoplazmy i przekazywać informacji. Synteza białek jest możliwa dzięki m-RNA. W komórce eukariotycznej transkrypcja zachodzi z ogromną szybkością. Najpierw pojawia się pro-i-RNA lub pre-i-RNA. Wyjaśnia to fakt, że u eukariontów mRNA powstaje w wyniku przetwarzania (dojrzewania). Gen ma strukturę nieciągłą. Regiony kodujące to eksony, a regiony niekodujące to introny. Gen u organizmów eukariotycznych ma strukturę ekson-intron. Intron jest dłuższy niż ekson. Podczas przetwarzania introny są „wycinane” – splicing. Po utworzeniu dojrzałego mRNA, po interakcji ze specjalnym białkiem, przechodzi on do układu – informosomu, który przenosi informację do cytoplazmy. Obecnie systemy ekson-intron są dobrze zbadane (na przykład onkogen P-53). Czasami introny jednego genu są eksonami innego genu, wówczas splicing jest niemożliwy. Przetwarzanie i splicing umożliwiają łączenie oddalonych od siebie struktur w jeden gen, dlatego mają ogromne znaczenie ewolucyjne. Takie procesy upraszczają specjację. Białka mają budowę blokową. Na przykład enzymem jest polimeraza DNA. Jest to ciągły łańcuch polipeptydowy. Składa się z własnej polimerazy DNA i endonukleazy, która odcina cząsteczkę DNA od końca. Enzym składa się z 2 domen, które tworzą 2 niezależne zwarte cząstki połączone mostkiem polipeptydowym. Na granicy pomiędzy 2 genami enzymatycznymi znajduje się intron. Domeny były kiedyś oddzielnymi genami, ale potem zbliżyły się do siebie. Naruszenie takiej struktury genu prowadzi do chorób genowych. Naruszenie struktury intronu jest fenotypowo niewidoczne, naruszenie sekwencji eksonów prowadzi do mutacji (mutacji genów globiny).
10-15% RNA w komórce to RNA transferowy. Istnieją regiony uzupełniające. Istnieje specjalna trójka – antykodon, trójka nie posiadająca komplementarnych nukleotydów – GGC. Interakcja dwóch podjednostek rybosomu i mRNA prowadzi do inicjacji. Istnieją 2 miejsca - pektydyl i aminoacyl. Odpowiadają aminokwasom. Synteza polipeptydów zachodzi krok po kroku. Elongacja – proces budowy łańcucha polipeptydowego trwa aż do osiągnięcia kodonu nonsensownego, po czym następuje zakończenie. Synteza kończy się polipeptydem, który następnie wchodzi do kanałów ER. Podjednostki oddalają się od siebie. W komórce syntetyzowane są różne ilości białka.