Gen terapiyası. Gen terapiyası - Necə işləyir, nəyi müalicə edir, müsbət və mənfi cəhətləri Gen terapiyasının üzləşdiyi problemlər

14943 0

Mutasiyaları spesifik xəstəliklərə səbəb olan genin yerinin və ardıcıllığının müəyyən edilməsi, həmçinin mutasiyanın özü və onun müasir sınaq üsulları orqanizmin inkişafının neo- və hətta prenatal dövründə xəstəliyin diaqnozunu qoymağa imkan verir. Bu, dərman, pəhriz, qanköçürmə və s. köməyi ilə genetik qüsurun təzahürünü azaltmağa imkan verir.

Lakin bu yanaşma qüsurun özünün düzəldilməsinə gətirib çıxarmır və bir qayda olaraq, irsi xəstəliklər müalicə olunmur. Vəziyyəti daha da çətinləşdirir ki, bir gendəki mutasiya orqanizmə çox fərqli təsirlər göstərə bilər. Əgər gen mutasiyası onun kodlaşdırdığı fermentin fəaliyyətində dəyişikliklərə səbəb olarsa, bu, zəhərli substratın toplanmasına və ya əksinə, hüceyrənin normal fəaliyyəti üçün zəruri olan birləşmənin çatışmazlığına səbəb ola bilər.

Belə bir xəstəliyin məşhur nümunəsi fenilketonuriyadır. Bu, fenilalaninin tirozinə çevrilməsini kataliz edən qaraciyər fermenti fenilalanin dehidroksilaza genindəki mutasiya nəticəsində yaranır. Nəticədə qanda endogen fenilalaninin səviyyəsi yüksəlir ki, bu da mərkəzi sinir sisteminin sinir hüceyrələrinin aksonları ətrafında miyelin qabığının düzgün formalaşmamasına və nəticədə ağır əqli geriliyə səbəb olur.

Bir mutasiya struktur zülal geninə təsir edərsə, hüceyrələr, toxumalar və ya orqanlar səviyyəsində ciddi pozğunluqlara səbəb ola bilər. Belə bir xəstəliyin nümunəsi kistik fibrozdur.

Kistik fibroz daşıyıcısı adlanan proteini kodlayan genin silinməsi zülal sintezinin pozulmasına (fenilalanin 508 çatışmazlığı) və xlorid ionlarının hüceyrə membranları vasitəsilə daşınmasının pozulmasına səbəb olur. Bunun ən zərərli təsirlərindən biri də ağciyərləri əhatə edən və qoruyan selikin anormal dərəcədə qalınlaşmasıdır. Bu, ağciyər hüceyrələrinə daxil olmağı çətinləşdirir və zərərli mikroorqanizmlərin yığılmasına kömək edir. Ağciyərlərin tənəffüs yollarını əhatə edən hüceyrələr ölür və onların yerini lifli çapıq toxuması alır (xəstəliyin adı da buna görədir). Nəticədə xəstə tənəffüs çatışmazlığından ölür.

İrsi xəstəliklər mürəkkəb klinik təzahürlərə malikdir və onların ənənəvi müalicəsi əsasən simptomatikdir: fenilketonuriyanı müalicə etmək üçün alaninsiz pəhriz təyin edilir, qüsurlu zülallar funksional venadaxili administrasiya ilə əvəz olunur, itirilmiş funksiyaları kompensasiya etmək üçün sümük iliyi və ya digər orqan transplantasiyası aparılır. . Bütün bu tədbirlər adətən səmərəsiz, bahalı, vaxt aparan olur və yalnız bir neçə xəstə qocalığa qədər yaşayır. Buna görə də, prinsipcə yeni terapiya növlərinin inkişafı çox vacibdir.

Gen terapiyası

Gen terapiyası bir xəstəliyə səbəb olan genetik qüsuru düzəltməyə yönəlmiş insan somatik hüceyrələrinin genetik mühəndisliyidir. Müəyyən bir xəstəliyin korreksiyası normal ifadə olunan genlərin qüsurlu somatik hüceyrələrə daxil edilməsi ilə həyata keçirilir. 1980-ci illərdə fərdi genlərin alınması üsulları işlənib hazırlandıqda və eukaryotik ifadə vektorları yaradıldıqda, siçanlarda gen transferi təcrübələri adi hala çevrildi və genlərin korreksiyası perspektivləri reallaşdı.

1990-cı ildə ABŞ-da doktor W.Fransız Andrson üç yaşlı Ashanti da Silva qızında ağır kombinə edilmiş immun çatışmazlığını (SCID) müalicə etmək üçün gen terapiyasına ilk cəhd etdi. Bu xəstəliyə adenosanadenilaza (ADA) kodlayan genin mutasiyası səbəb olur. Bu fermentin çatışmazlığı qanda adenozin və deoksiadenozinin yığılmasına kömək edir, bunun toksik təsiri periferik qan B və T limfositlərinin ölümünə və nəticədə immun çatışmazlığına səbəb olur.

Bu xəstəliyi olan uşaqlar hər hansı bir infeksiyadan qorunmalıdır (xüsusi steril kameralarda saxlanılır), çünki hər hansı bir xəstəlik ölümcül ola bilər. Müalicənin başlanmasından dörd il sonra uşaqda normal fəaliyyət göstərən ADA ifadəsi və SCID simptomlarının aradan qalxması ona steril kameranı tərk etməyə və normal həyat sürməyə imkan verdi.

Beləliklə, somatik hüceyrələrin uğurlu genetik terapiyasının fundamental imkanları nümayiş etdirildi. 90-cı illərdən. Gen terapiyası bir sıra genetik xəstəliklər, o cümlədən hemofiliya, QİÇS, müxtəlif bədxassəli yenitörəmələr, kistik fibroz və s. kimi ağır xəstəliklər üçün sınaqdan keçirilir. Hazırda transgenez vasitəsilə insanda 10-a yaxın xəstəlik müalicə oluna bilər.

Genetik xəstəliklərin müxtəlifliyi bir çox gen terapiyası yanaşmalarının inkişafına səbəb olmuşdur. Bu zaman 2 əsas problem həll olunur: terapevtik genin çatdırılması vasitəsi; korreksiya üçün nəzərdə tutulmuş hüceyrələrə ünvanlı çatdırılmanı təmin etmək üçün bir üsul. Bu günə qədər somatik hüceyrələrin gen terapiyasına bütün yanaşmaları iki kateqoriyaya bölmək olar: ex vivo və in vivo terapiya (Şəkil 3.15).

düyü. 3.15. Ex vivo (a) və in vivo (a) gen terapiyasının sxemi

Ex vivo gen terapiyası bədəndən kənarda qüsurlu hüceyrələrin genetik korreksiyasını və sonra normal fəaliyyət göstərən hüceyrələrin bədənə qaytarılmasını nəzərdə tutur.

In vivo gen terapiyası terapevtik genin birbaşa müəyyən bir xəstə toxumasının hüceyrələrinə çatdırılmasını əhatə edir. Bu yanaşmaları daha ətraflı nəzərdən keçirək.

Ex vivo gen terapiyası aşağıdakı addımları əhatə edir:
1) xəstədən qüsurlu hüceyrələrin alınması və onların kultivasiyası;
2) terapevtik gen konstruksiyasının transfeksiyasından istifadə edərək, istənilən genin təcrid olunmuş hüceyrələrə köçürülməsi;
3) genetik korrektə edilmiş hüceyrələrin seçilməsi və genişləndirilməsi;
4) bu hüceyrələrin xəstəyə transplantasiyası və ya köçürülməsi.

Xəstənin öz hüceyrələrindən istifadə onların geri qaytarıldığı zaman immun reaksiya verməməsini təmin edir. Gen konstruksiyasının ötürülməsi proseduru effektiv olmalıdır və normal gen sabit saxlanılmalı və davamlı olaraq ifadə edilməlidir.

Təbiətin özünün yaratdığı gen köçürmə vasitələri viruslardır. Gen çatdırılması üçün effektiv vektorlar əldə etmək üçün əsasən iki qrup virusdan istifadə olunur - adenoviruslar və retroviruslar (Şəkil 3.16). Gen terapiyasında genetik cəhətdən zərərsizləşdirilmiş virusların variantlarından istifadə olunur.

düyü. 3.16. Viruslar terapevtik vektorlar yaratmaq üçün istifadə olunur

Retroviruslara əsaslanan dizaynların dizaynını və istifadəsini nəzərdən keçirək. Xatırladaq ki, retrovirusun genomu hər biri altı hissədən ibarət iki eyni təkzəncirli RNT molekulu ilə təmsil olunur: 5" və 3" uclarında iki uzun terminal təkrarı (LTR), kodlaşdırılmayan ardıcıllıq * RNT-nin viral hissəcikdə qablaşdırılması üçün zəruri olan P+ və daxili kapsidin (qag), əks transkriptazın (pol) və zərf zülalının (zərf) struktur zülalını kodlayan üç bölgə (Şəkil 3.17a).

düyü. 3.17. Tipik bir retrovirusun genetik xəritəsi (a) və retrovirus vektorunun xəritəsi (a)

Xatırladaq ki, retrovirusun həyat dövrü aşağıdakı mərhələləri əhatə edir:
1. Hədəf hüceyrələrin infeksiyası.
2. Öz əks transkriptazasından istifadə edərək genomun DNT surətinin sintezi.
3. Viral DNT-nin nüvəyə daşınması.
4. Viral DNT-nin ev sahibi hüceyrə xromosomuna daxil edilməsi.
5. 5"-LTR bölgəsində lokallaşdırılmış güclü promotorun nəzarəti altında viral DNT-dən mRNT-nin transkripsiyası.
6. Gag, Pol və Env zülallarının tərcüməsi.
7. Viral kapsidin əmələ gəlməsi və iki RNT zəncirinin və əks transkriptaza molekullarının qablaşdırılması.
8. Virionların hüceyrədən ayrılması.

Retrovirus vektoru əldə edərkən, retrovirusun tam uzunluqlu DNT-si plazmidə daxil edilir, gag geninin çox hissəsi və bütün pol və env genləri çıxarılır və onların yerinə "terapevtik" T geni və lazım olduqda. , öz promotoru olan selektiv marker geni Rg daxil edilir (Şəkil 3.17, b). T geninin transkripsiyası 5"-LTR bölgəsində lokallaşdırılmış eyni güclü promotor tərəfindən idarə olunacaq. Bu sxem əsasında müxtəlif retrovirus vektorlar və təxminən 8 min bp-lik maksimum DNT insert ölçüsü yaradılmışdır.

Bu şəkildə əldə edilən konstruksiya özü transformasiya üçün istifadə oluna bilər, lakin onun effektivliyi və sonradan ev sahibi hüceyrə genomuna inteqrasiyası olduqca aşağıdır. Buna görə də, retrovirus vektorunun tam uzunluqlu RNT-ni hüceyrəyə yüksək tezlikdə nüfuz edən və ev sahibinin genomuna inteqrasiyasına zəmanət verən bütöv viral hissəciklərə qablaşdırmaq üçün bir texnika hazırlanmışdır. Bu məqsədlə “qablaşdırma” adlanan hüceyrə xətti yaradılmışdır. Bu hüceyrələrin xromosomlarının iki fərqli bölməsində retrovirus genləri gag və pol-env yerləşmiş, ardıcıllığın olmaması səbəbindən paketlənmə qabiliyyətindən məhrum edilmiş + (84*+) (Şəkil 3.18).

düyü. 3.18. Paketlənmiş virus vektorunun alınması sxemi

Yəni bu fraqmentlərin hər ikisi transkripsiya edilir, lakin RNT-dən məhrum boş kapsidlər əmələ gəlir. Viral vektor RNT-si belə hüceyrələrə transfeksiya edildikdə, o, xromosom DNT-yə inteqrasiya olunur və tam uzunluqlu retrovirus RNT-ni əmələ gətirmək üçün transkripsiya edilir və belə şəraitdə yalnız vektor RNT kapsidlərə qablaşdırılır (yalnız onun tərkibində + ardıcıllığı var). Yaranan bütöv viral hissəciklər retrovirus vektorunun hədəf hüceyrələrə səmərəli çatdırılması üçün istifadə olunur.

Retroviruslar yalnız sürətlə bölünən hüceyrələri aktiv şəkildə yoluxdurur. Genləri köçürmək üçün onlar qablaşdırılmış retrovirus vektorunun təmizlənmiş hissəcikləri ilə müalicə olunur və ya onları əmələ gətirən hüceyrə xətti ilə birgə kulturasiya edilir və sonra hədəf hüceyrələri qablaşdırma hüceyrələrindən ayırmaq üçün seçilir.

Transduksiya edilmiş hüceyrələr terapevtik gen məhsulunun sintez səviyyəsi, replikasiya səlahiyyətli retrovirusların olmaması və hüceyrələrin böyüməsi və ya işləmə qabiliyyətində dəyişikliklərin olmaması üçün diqqətlə yoxlanılır.

Sümük iliyi hüceyrələri gen terapiyası üçün ən uyğundur. Bu, müxtəlif növ hüceyrələrə - B və T limfositlərinə, makrofaqlara, eritrositlərə, trombositlərə və osteoklastlara çoxalaraq fərqlənə bilən totipotent embrion kök hüceyrələrinin olması ilə əlaqədardır. Məhz bu hüceyrələr bir sıra irsi xəstəliklərin, o cümlədən artıq qeyd olunan ağır birləşmiş immun çatışmazlığı, Qauçer xəstəliyi, oraq hüceyrəli anemiya, talassemiya, osteoporoz və s.

Təcrid edilməsi və kulturasiyası çətin olan totipotent sümük iliyinin kök hüceyrələrindən əlavə, hiperkolesterolemiyanın müalicəsi üçün göbək qanından (yeni doğulmuşlarda gen terapiyası üçün üstünlük verilən istifadə) kök hüceyrələrdən, həmçinin qaraciyər hüceyrələrindən - hepatositlərdən istifadə olunur.

In vivo gen terapiyası, terapevtik genin qüsurlu hüceyrələrə çatdırılmasını təmin etmək xüsusilə vacibdir. Bu cür hədəflənmiş çatdırılma, müəyyən hüceyrə növlərini yoluxdura bilən viruslar əsasında yaradılmış dəyişdirilmiş vektorlarla təmin edilə bilər. Yuxarıda qeyd olunan kistik fibrozun müalicəsi üçün hazırlanmış yanaşmanı nəzərdən keçirək. Ağciyərlər açıq boşluq olduğu üçün onlara müalicəvi genləri çatdırmaq nisbətən asandır. Sağlam genin klonlanmış versiyası inaktivləşdirilmiş adenovirusa daxil edilmişdir (Şəkil 3.19). Bu tip virusun spesifikliyi ondan ibarətdir ki, ağciyərlərin selikli qişasını yoluxduraraq soyuqdəyməyə səbəb olur.

düyü. 3.19. Adenovirus əsasında vektorun alınması sxemi

Bu şəkildə qurulan virus eksperimental heyvanların burunlarına və ağciyərlərinə, sonra isə insan xəstələrinə səpilərək sınaqdan keçirildi. Bəzi hallarda sağlam genin tətbiqi və ifadəsi və normal xlorid ionunun nəqlinin bərpası müşahidə edilmişdir. Ola bilsin ki, bu yanaşma (burun spreylərindən istifadə edərək normal genin tətbiqi) yaxın gələcəkdə ağciyərlərdə kistik fibroz əlamətlərini müalicə etmək üçün geniş istifadə olunsun.

Gen terapiyası təcrübələrində retro və adenoviruslara əlavə olaraq digər virus növləri də istifadə olunur, məsələn, Herpes simplex virusu. Bu iki zəncirli (152 kb) DNT virusunun xüsusi xüsusiyyəti onun neyronları xüsusi şəkildə yoluxdurmaq qabiliyyətidir. Mərkəzi və periferik sinir sisteminə təsir edən bir çox genetik xəstəliklər - şişlər, metabolik pozğunluqlar, neyrodegenerativ xəstəliklər (Alzheimer xəstəliyi, Parkinson xəstəliyi) məlumdur.

Herpes simplex virus tip I (HSV) bu cür xəstəliklərin müalicəsi üçün çox uyğun bir vektordur. Bu virusun kapsidi neyron membranı ilə birləşir və onun DNT-si nüvəyə daşınır. HSV vektorlarından istifadə edərək terapevtik genin ötürülməsi üçün bir neçə üsul təklif edilmiş və eksperimental heyvanlar üzərində uğurlu sınaqlar aparılmışdır.

Viral vektorların bir sıra çatışmazlıqları var: yüksək qiymət, məhdud klonlama qabiliyyəti və mümkün iltihab reaksiyası. Beləliklə, 1999-cu ildə adenoviral vektorun tətbiqinə qarşı qeyri-adi güclü immun reaksiyanın inkişafı nəticəsində dərman sınaqlarında iştirak edən 18 yaşlı könüllü öldü. 2002-ci ildə Fransada iki uşaq immun çatışmazlığından müalicə olunarkən (retroviruslardan istifadə edərək kök hüceyrələrə terapevtik genlər daxil etməklə) leykemiyaya bənzər bir xəstəlik inkişaf etdirdi.

Buna görə də, qeyri-viral gen çatdırma sistemləri hazırlanır. Ən sadə və təsirsiz üsul plazmid DNT-ni toxumalara yeritməkdir. İkinci yanaşma, toxumaların DNT ilə konjuge edilmiş qızıl mikrohissəciklərlə (1-3 mikron) bombardman edilməsidir. Bu vəziyyətdə terapevtik genlər hədəf toxumalarda ifadə edilir və onların məhsulları - terapevtik zülallar qana daxil olur. Bu yanaşmanın əsas çatışmazlığı bu zülalların qan komponentləri tərəfindən vaxtından əvvəl inaktivasiyası və ya məhv edilməsidir.

DNT süni lipid qabığında qablaşdırılaraq çatdırıla bilər. Bu yolla əldə edilən sferik lipozom hissəcikləri hüceyrə membranına asanlıqla nüfuz edir. Müxtəlif xüsusiyyətlərə malik liposomlar yaradılmışdır, lakin bu günə qədər bu cür çatdırılmanın effektivliyi aşağıdır, çünki DNT-nin çox hissəsi lizosomal məhvə məruz qalır. Həmçinin, genetik konstruksiyanı çatdırmaq üçün DNT konjugatları onun təhlükəsizliyini, məqsədyönlü çatdırılmasını və hüceyrəyə daxil olmasını təmin edə bilən müxtəlif molekullarla sintez edilir.

Son illərdə bir və ya bir neçə terapevtik gen üçün tənzimləyici elementlərin tam dəstinə malik böyük miqdarda genetik materialı daxil etməyə imkan verən süni 47-ci xromosomun yaradılması üçün intensiv təcrübələr aparılmışdır. Bu, terapevtik genin genomik variantından istifadə etməyə və bununla da onun sabitliyini və uzunmüddətli effektiv ifadəsini təmin etməyə imkan verərdi. Təcrübələr göstərdi ki, tərkibində terapevtik genlər olan süni insan xromosomunun yaradılması tamamilə mümkündür, lakin belə nəhəng molekulun hədəf hüceyrənin nüvəsinə necə daxil ediləcəyi hələ aydın deyil.

Gen terapiyasının qarşısında duran əsas problemlər ağır immun reaksiya riski ilə yanaşı, xəstənin orqanizmində müalicəvi DNT-nin uzunmüddətli saxlanması və fəaliyyət göstərməsinin çətinlikləri, bir çox xəstəliklərin multigenik olması, onları gen terapiyası üçün çətin hədəfə çevirməsidir. , və virusların vektor kimi istifadə riski.

ÜSTÜNDƏ. Voinov, T.G. Volova

Giriş

Hər il elmi jurnallarda bu və ya digər şəkildə müxtəlif genlərin - gen terapiyasının tətbiqinə əsaslanan müalicənin tətbiq edildiyi tibbi klinik tədqiqatlar haqqında daha çox məqalə dərc olunur. Bu istiqamət biologiyanın molekulyar genetika və biotexnologiya kimi yaxşı inkişaf edən sahələrindən yaranmışdır.

Çox vaxt, ənənəvi (mühafizəkar) üsullar artıq sınaqdan keçirildikdə, xəstələrin sağ qalmasına və hətta tam sağalmasına kömək edən gen terapiyasıdır. Məsələn, bu, irsi monogen xəstəliklərə, yəni bir genin qüsuru nəticəsində yarananlara, eləcə də bir çox başqalarına aiddir. Və ya, məsələn, gen terapiyası aşağı ətraflarda qan damarlarının lümenini daraltmış və nəticədə ətrafdakı toxumaların davamlı işemiyası inkişaf etmiş, yəni bu toxumalar yaşamış xəstələrin əzalarını xilas edə və xilas edə bilər. normal olaraq qanla bütün bədənə daşınan qida və oksigenin kəskin çatışmazlığı. Bu cür xəstələri cərrahi manipulyasiyalar və dərmanlarla müalicə etmək çox vaxt mümkün deyil, lakin hüceyrələr yerli olaraq yeni damarların əmələ gəlməsi və cücərmə prosesinə təsir edəcək daha çox protein faktoru buraxmağa məcbur olarsa, işemiya daha az təzahür edər və həyat olur. xəstələr üçün daha asandır.

Gen terapiyası Bu gün, gen qüsurlarını xüsusi olaraq dəyişdirmək və ya hüceyrələrə yeni funksiyalar vermək üçün xəstələrin hüceyrələrinə genlər daxil etməklə xəstəliklərin müalicəsi kimi təyin edilə bilər. Gen terapiyası üsullarının ilk klinik sınaqları bu yaxınlarda - 22 may 1989-cu ildə xərçəngin diaqnostikası məqsədi ilə aparılmışdır. Gen terapiyası üsullarının tətbiq edildiyi ilk irsi xəstəlik irsi immun çatışmazlığı idi.

Hər il gen terapiyasından istifadə etməklə müxtəlif xəstəliklərin müalicəsi üçün uğurla aparılan kliniki sınaqların sayı artır və 2014-cü ilin yanvar ayına qədər bu, 2 minə çatıb.

Eyni zamanda, gen terapiyası ilə bağlı müasir tədqiqatlarda nəzərə almaq lazımdır ki, genlərin və ya “qarışdırılmış” (rekombinant) DNT-nin manipulyasiyasının nəticələri in vivo(latınca sözün əsl mənasında “canlıda”) kifayət qədər öyrənilməmişdir. Bu sahədə ən qabaqcıl tədqiqat səviyyəsinə malik ölkələrdə, xüsusən də ABŞ-da, sensual DNT ardıcıllığından istifadə edən tibbi protokollar müvafiq komitələr və komissiyalar tərəfindən məcburi şəkildə nəzərdən keçirilir. ABŞ-da bunlar Rekombinant DNT Məsləhət Komitəsi (RAC) və Qida və Dərman Administrasiyasıdır (FDA) sonradan layihənin Milli Sağlamlıq İnstitutunun direktoru tərəfindən məcburi təsdiqi ilə.

Beləliklə, biz qərara gəldik ki, bu müalicə bədənin bəzi toxumalarında müəyyən fərdi zülal amillərində çatışmazlıq varsa, bu toxumalara zülalları kodlayan müvafiq genlərin daxil edilməsi ilə düzəldilə bilər və hər şey daha çox və ya daha çox olacaq. daha az gözəl. Zülalların özlərini təqdim etmək mümkün olmayacaq, çünki bədənimiz dərhal güclü bir immunitet reaksiyası ilə reaksiya verəcək və fəaliyyət müddəti qeyri-kafi olacaq. İndi genin hüceyrələrə çatdırılma üsuluna qərar verməlisiniz.

Transfeksiya hüceyrələr

Əvvəlcə bəzi terminlərin təriflərini təqdim etməyə dəyər.

Gen nəqli sayəsində həyata keçirilir vektor genetik məlumatın hüceyrəyə süni şəkildə ötürülməsi üçün “nəqliyyat vasitəsi” kimi istifadə edilən DNT molekuludur. Vektorların bir çox növləri var: plazmid, viral, həmçinin kosmidlər, fazmidlər, süni xromosomlar və s. Vektorların (xüsusən plazmidlərin) onlara xas olan xassələrə malik olması prinsipial olaraq vacibdir:

1. Replikasiyanın mənşəyi (ori)- DNT duplikasiyasının başladığı nukleotidlərin ardıcıllığı. Vektor DNT ikiqat arta bilmirsə (replikasiya edə bilmirsə), onda lazımi terapevtik effekt əldə edilməyəcək, çünki o, sadəcə olaraq hüceyrədaxili nukleaza fermentləri tərəfindən tez parçalanacaq və şablonların olmaması səbəbindən son nəticədə daha az protein molekulu əmələ gələcək. Qeyd etmək lazımdır ki, bu nöqtələr hər bir bioloji növ üçün spesifikdir, yəni vektor DNT-nin bakterial mədəniyyətdə çoxaldılması (və yalnız kimyəvi sintez yolu ilə deyil, adətən daha bahalı olan) əldə edilməlisə, onda iki replikasiyanın ayrı mənşəyi tələb olunacaq - insanlar və bakteriyalar üçün;

2. Məhdudiyyət saytları- xüsusi fermentlər (məhdudiyyət endonükleazları) tərəfindən tanınan və onlar tərəfindən müəyyən bir şəkildə kəsilən xüsusi qısa ardıcıllıqlar (adətən palindromik) - "yapışqan ucların" meydana gəlməsi ilə (şəkil 1).

Şəkil.1 Restriksiya fermentlərinin iştirakı ilə “yapışqan ucların” əmələ gəlməsi

Bu saytlar vektor DNT-ni (bu, mahiyyət etibarilə “boşdur”) arzu olunan terapevtik genlərlə tək bir molekula birləşdirmək üçün lazımdır. İki və ya daha çox hissədən çarpaz bağlanmış belə bir molekul “rekombinant” adlanır;

3. Aydındır ki, biz rekombinant DNT molekulunun milyonlarla nüsxəsini əldə etmək istərdik. Yenə bakterial hüceyrə mədəniyyəti ilə məşğul oluruqsa, bu DNT-ni təcrid etmək lazımdır. Problem ondadır ki, bütün bakteriyalar bizə lazım olan molekulu qəbul etməyəcək, bəziləri bunu etməyəcək. Bu iki qrupu ayırd etmək üçün daxil edirlər seçici markerlər- müəyyən kimyəvi maddələrə qarşı müqavimət sahələri; İndi bu maddələri ətraf mühitə əlavə etsəniz, yalnız onlara davamlı olanlar sağ qalacaq, qalanları isə öləcək.

Bütün bu üç komponenti ilk süni şəkildə sintez edilmiş plazmiddə müşahidə etmək olar (şəkil 2).

Şəkil 2

Müəyyən hüceyrələrə plazmid vektorunun daxil edilməsi prosesi deyilir transfeksiya. Plazmid, bakteriya hüceyrəsinin sitoplazmasında olan kifayət qədər qısa və adətən dairəvi DNT molekuludur. Plazmidlər bakteriya xromosomu ilə əlaqəli deyil, ondan asılı olmayaraq çoxalda bilər, bakteriya tərəfindən ətraf mühitə buraxıla bilər və ya əksinə udulur (udma prosesi transformasiya). Plazmidlərin köməyi ilə bakteriyalar genetik məlumat mübadiləsi edə bilər, məsələn, müəyyən antibiotiklərə qarşı müqaviməti ötürə bilər.

Plazmidlər təbii olaraq bakteriyalarda mövcuddur. Amma heç kim tədqiqatçının ehtiyac duyduğu xüsusiyyətlərə malik olacaq plazmidi süni şəkildə sintez edib, ona gen inserti daxil edib hüceyrəyə daxil etməsinə mane ola bilməz. Eyni plazmidə müxtəlif əlavələr daxil edilə bilər .

Gen terapiyası üsulları

Hədəf hüceyrələrinin təbiətinə görə fərqlənən iki əsas yanaşma var:

1. İnkişafın erkən mərhələsində yad DNT-nin ziqota (mayalanmış yumurta) və ya embriona daxil edildiyi fetal; bu halda, təqdim edilən materialın alıcının bütün hüceyrələrinə (və hətta mikrob hüceyrələrinə) daxil olacağı və bununla da növbəti nəslə ötürülməsi gözlənilir. Ölkəmizdə əslində qadağandır;

2. Somatik, burada genetik material artıq doğulmuş insanın reproduktiv olmayan hüceyrələrinə daxil olur və germ hüceyrələrinə ötürülmür.

Gen terapiyası in vivo klonlanmış (çoxaldılmış) və qablaşdırılmış DNT ardıcıllığının müəyyən bir şəkildə xəstənin müəyyən toxumalarına birbaşa yeridilməsinə əsaslanır. Gen xəstəliklərinin in vivo müalicəsi üçün xüsusilə perspektivli aerozol və ya inyeksiya edilmiş vaksinlərdən istifadə edərək genlərin tətbiqidir. Aerozol gen terapiyası, bir qayda olaraq, ağciyər xəstəliklərinin (kistik fibroz, ağciyər xərçəngi) müalicəsi üçün hazırlanmışdır.

Gen terapiyası proqramının hazırlanmasında bir çox addımlar var. Buraya müvafiq genin toxuma spesifik ifadəsinin hərtərəfli təhlili (yəni müəyyən toxumada bəzi zülalın geninin matrisi üzərində sintez) və ilkin biokimyəvi qüsurun müəyyən edilməsi, strukturun, funksiyanın öyrənilməsi daxildir. və onun protein məhsulunun hüceyrədaxili paylanması, həmçinin patoloji prosesin biokimyəvi təhlili. Bütün bu məlumatlar müvafiq tibbi protokol tərtib edilərkən nəzərə alınır.

Gen korreksiyası sxemlərini tərtib edərkən hüceyrə mədəniyyəti şəraitində transfeksiyanın effektivliyinin və ilkin biokimyəvi qüsurun düzəldilmə dərəcəsinin qiymətləndirilməsi vacibdir ( in vitro,"in vitro") və ən əsası, in vivo heyvan bioloji modelləri üzrə. Yalnız bundan sonra klinik sınaq proqramı başlaya bilər .

Terapevtik genlərin birbaşa çatdırılması və hüceyrə daşıyıcıları

Yad DNT-ni eukaryotik hüceyrəyə daxil etməyin bir çox üsulu var: bəziləri fiziki emaldan (elektroporasiya, maqnitofeksiya və s.), digərləri kimyəvi materialların və ya daşıyıcı kimi istifadə olunan bioloji hissəciklərin (məsələn, viruslar) istifadəsindən asılıdır. Dərhal qeyd etmək lazımdır ki, kimyəvi və fiziki üsullar adətən birləşdirilir (məsələn, elektroporasiya + lipozomlarda DNT-nin sarılması)

Birbaşa üsullar

1. Kimyəvi əsaslı transfeksiya bir neçə növə təsnif edilə bilər: siklodekstrin maddəsi, polimerlər, liposomlar və ya nanohissəciklərdən istifadə etməklə (kimyəvi və ya viral funksionallaşdırma ilə və ya onsuz, yəni səth modifikasiyası).
a) Ən ucuz üsullardan biri kalsium fosfatdan istifadə etməkdir. DNT-nin hüceyrələrə daxil olmasının effektivliyini 10-100 dəfə artırır. DNT kalsiumla güclü kompleks əmələ gətirir ki, bu da onun effektiv udulmasını təmin edir. Dezavantaj - DNT-nin yalnız təxminən 1 - 10% -i nüvəyə çatır. İstifadə olunan üsul in vitro DNT-nin insan hüceyrələrinə köçürülməsi üçün (şək. 3);

şək.3

b) DNT-ni bağlamaq və hüceyrəyə köçürmək üçün yüksək budaqlanmış üzvi molekulların - dendrimerin istifadəsi (şək. 4);

Şəkil 4

c) DNT-ni transfeksiya etmək üçün çox təsirli bir üsul onun liposomlar - ikiqat lipid təbəqəsi olan hüceyrə sitoplazmatik membranı (CPM) ilə birləşə bilən kiçik, membranla əhatə olunmuş cisimlər vasitəsilə daxil edilməsidir. Eukaryotik hüceyrələr üçün transfeksiya katyonik liposomlardan istifadə etməklə daha səmərəli olur, çünki hüceyrələr onlara daha həssasdır. Prosesin öz adı var - lipofeksiya. Bu üsul bu gün ən təhlükəsizlərdən biri hesab olunur. Liposomlar qeyri-toksik və qeyri-immunogendir. Bununla belə, liposomlardan istifadə edərək gen transferinin səmərəliliyi məhduddur, çünki onların hüceyrələrə daxil etdikləri DNT adətən lizosomlar tərəfindən dərhal tutulur və məhv edilir. Liposomlardan istifadə edərək insan hüceyrələrinə DNT-nin daxil edilməsi bu gün terapiyanın əsas istiqamətidir. in vivo(şək. 5);

Şəkil 5

d) Başqa bir üsul dietilaminoetil dekstran və ya polietilenimin kimi katyonik polimerlərin istifadəsidir. Mənfi yüklü DNT molekulları müsbət yüklü polikatyonlara bağlanır və bu kompleks daha sonra endositozla hüceyrəyə daxil olur. DEAE-dekstran plazma membranının fiziki xassələrini dəyişir və bu kompleksin hüceyrəyə daxil olmasını stimullaşdırır. Metodun əsas çatışmazlığı DEAE-dekstranın yüksək konsentrasiyalarda zəhərli olmasıdır. Metod gen terapiyasında geniş yayılmamışdır;

e) Histonların və digər nüvə zülallarının köməyi ilə. Tərkibində çoxlu müsbət yüklü amin turşuları (Lys, Arg) olan bu zülallar təbii şəraitdə uzun DNT zəncirini nisbətən kiçik hüceyrə nüvəsinə yığışdırmağa kömək edir.

2. Fiziki üsullar:

a) Elektroporasiya çox məşhur üsuldur; Membran keçiriciliyinin dərhal artması hüceyrələrin sıx elektrik sahəsinə qısa müddət ərzində məruz qalması ilə əldə edilir. Göstərilmişdir ki, optimal şəraitdə transformantların sayı sağ qalan hüceyrələrin 80%-nə çata bilər. Hal-hazırda insanlarda istifadə edilmir (şək. 6).

Şəkil 6

b) "Hüceyrə sıxma" 2013-cü ildə icad edilmiş bir üsuldur. Hüceyrə membranını "yumşaq sıxaraq" molekulları hüceyrələrə çatdırmağa imkan verir. Metod xarici materiallara və ya elektrik sahələrinə etibar etmədiyi üçün toksiklik və ya yanlış hədəflənmə ehtimalını aradan qaldırır;

c) Sonoporasiya yad DNT-nin hüceyrə membranında məsamələrin açılmasına səbəb olan ultrasəsə məruz qalaraq hüceyrələrə süni şəkildə köçürülməsi üsuludur;
d) Optik transfeksiya - yüksək fokuslanmış lazerdən istifadə etməklə membranda kiçik dəliyin (diametri təxminən 1 mkm) açıldığı üsul;
e) Hidrodinamik transfeksiya - genetik konstruksiyaların, zülalların və s. çatdırılma üsulu. hüceyrə membranlarının keçiriciliyinin qısamüddətli artmasına və onlarda müvəqqəti məsamələrin əmələ gəlməsinə səbəb olan kapilyarlarda və hüceyrələrarası mayedə təzyiqin idarə olunan artması ilə. Dokuya sürətli inyeksiya yolu ilə həyata keçirilir və çatdırılma qeyri-spesifikdir. Skelet əzələsi üçün çatdırılma səmərəliliyi - 22-60% ;

f) DNT-nin mikroinyeksiyası - nazik şüşə mikrotubullardan (d=0,1-0,5 µm) istifadə etməklə heyvan hüceyrəsinin nüvəsinə daxil edilməsi. Dezavantaj metodun mürəkkəbliyidir, nüvənin və ya DNT-nin məhv olma ehtimalı yüksəkdir; məhdud sayda hüceyrə çevrilə bilər. İnsan istifadəsi üçün deyil.

3. Hissəciklərə əsaslanan üsullar.

a) Transfeksiyaya birbaşa yanaşma gen silahıdır, burada DNT inert bərk maddələrlə (adətən qızıl, volfram) nanohissəcikdə birləşdirilir və sonra hədəf hüceyrələrin nüvələrinə yönəldilir. Bu üsul tətbiq olunur in vitro Və in vivo genlərin, xüsusən də əzələ toxuması hüceyrələrinə daxil edilməsi üçün, məsələn, Duchenne əzələ distrofiyası kimi bir xəstəlikdə. Qızıl hissəciklərinin ölçüsü 1-3 mikrondur (şək. 7).

Şəkil 7

b) Magnetofeksiya DNT-ni hədəf hüceyrələrə çatdırmaq üçün maqnit qüvvələrindən istifadə edən bir üsuldur. Əvvəlcə nuklein turşuları (NA) maqnit nanohissəciklərlə əlaqələndirilir, sonra isə maqnit sahəsinin təsiri altında hissəciklər hüceyrəyə sürülür. Effektivlik demək olar ki, 100% -dir, aşkar qeyri-toksiklik qeyd olunur. 10-15 dəqiqə ərzində hissəciklər hüceyrədə qeydə alınır - bu, digər üsullardan çox daha sürətlidir.
c) İmpalefection; "əsmə", tərcümədə "impalement" + "infeksiya") - karbon nanoborucuqları və nanoliflər kimi nanomateriallardan istifadə etməklə çatdırılma üsulu. Bu halda hüceyrələr sözün əsl mənasında nanofibril təbəqəsi ilə deşilir. “Nano” prefiksi onların çox kiçik ölçülərini (metrin milyardda biri daxilində) ifadə etmək üçün istifadə olunur (şək. 8).

Şəkil 8

RNT transfeksiyası kimi bir üsulu ayrıca vurğulamağa dəyər: hüceyrəyə DNT deyil, RNT molekulları - onların protein biosintezi zəncirindəki "varisləri"; bu vəziyyətdə RNT-ni qısa fraqmentlərə kəsən xüsusi zülallar aktivləşdirilir - sözdə. kiçik müdaxilə edən RNT (siRNA). Bu fraqmentlər digər zülallarla birləşir və nəticədə bu, hüceyrənin müvafiq genlərin ifadəsini maneə törədir. Bu yolla, potensial olaraq hazırda xeyirdən çox zərər verə bilən genlərin hüceyrədəki fəaliyyətinə mane olmaq mümkündür. RNT transfeksiyası, xüsusən də onkologiyada geniş tətbiq tapmışdır.

Plazmid vektorlarından istifadə edərək genlərin çatdırılmasının əsas prinsipləri nəzərdən keçirilir. İndi viral üsulları nəzərdən keçirməyə davam edə bilərik. Viruslar qeyri-hüceyrəvi həyat formalarıdır, əksər hallarda zülal qabığına bükülmüş nuklein turşusu molekulundan (DNT və ya RNT) ibarətdir. Əgər siz virusun genetik materialından xəstəliklərə səbəb olan bütün ardıcıllığı kəssəniz, o zaman bütün virus da uğurla genimiz üçün “avtomobil”ə çevrilə bilər.

Virusun vasitəçiliyi ilə DNT-nin hüceyrəyə daxil edilməsi prosesi deyilir transduksiya.
Təcrübədə ən çox istifadə olunanlar retroviruslar, adenoviruslar və adeno-assosiativ viruslardır (AAV). Birincisi, viruslar arasında ötürülmə üçün ideal namizədin nə olması lazım olduğunu anlamağa dəyər. Meyarlar belə olmalıdır:

Stabil;
. tutumlu, yəni kifayət qədər miqdarda DNT yerləşdirmək;
. hüceyrənin metabolik yollarına münasibətdə inert;
. dəqiq - ideal olaraq, o, öz genomunu ev sahibi nüvənin genomunun xüsusi lokusuna inteqrasiya etməlidir və s.

Real həyatda ən azı bir neçə məqamı birləşdirmək çox çətindir, ona görə də adətən seçim hər bir fərdi işi ayrıca nəzərdən keçirərkən edilir (şək. 9).

Şəkil 9

Sadalanan üç ən çox istifadə edilən viruslardan ən təhlükəsizi və eyni zamanda ən dəqiqi AAV-dir. Demək olar ki, onların yeganə çatışmazlığı nisbətən kiçik tutumlarıdır (təxminən 4800 bp), lakin bu, bir çox gen üçün kifayətdir. .

Sadalanan üsullara əlavə olaraq, gen terapiyası çox vaxt hüceyrə terapiyası ilə birlikdə istifadə olunur: birincisi, müəyyən insan hüceyrələrinin mədəniyyəti qida mühitinə əkilir, bundan sonra lazımi genlər hüceyrələrə bu və ya digər şəkildə daxil edilir, becərilir. bir müddət və təkrar ev sahibinin bədəninə köçürüldü. Nəticədə hüceyrələr normal xüsusiyyətlərinə qaytarıla bilər. Beləliklə, məsələn, insan ağ qan hüceyrələri (leykositlər) lösemi üçün dəyişdirilmişdir (Şəkil 10).

Şəkil 10

Hüceyrəyə daxil olduqdan sonra genin taleyi

Genləri son məqsədə - nüvəyə daha səmərəli çatdırmaq qabiliyyətinə görə viral vektorlarla hər şey az-çox aydın olduğundan, biz plazmid vektorunun taleyi üzərində dayanacağıq.

Bu mərhələdə DNT-nin ilk böyük maneəni - hüceyrənin sitoplazmatik membranını keçdiyinə nail olduq.

Bundan sonra, örtülmüş və ya olmayan digər maddələrlə birlikdə hüceyrə nüvəsinə çatmalıdır ki, xüsusi bir ferment - RNT polimeraza - bir DNT matrisində messenger RNT (mRNT) molekulunu sintez etsin (bu proses adlanır). transkripsiya). Yalnız bundan sonra mRNT sitoplazmaya buraxılacaq, ribosomlarla kompleks əmələ gətirir və genetik koda görə bir polipeptid sintez olunur - məsələn, müəyyən bir terapevtik funksiyanı yerinə yetirməyə başlayacaq damar böyümə faktoru (VEGF). bu halda, işemiyaya məruz qalan toxumada damarların budaqlanmasının formalaşması prosesinə başlayacaq) .

Tələb olunan hüceyrə tipində daxil edilmiş genlərin ifadəsinə gəlincə, bu problem transkripsiya tənzimləyici elementlərin köməyi ilə həll edilir. Ekspressiyanın baş verdiyi toxuma çox vaxt induksiya edilə bilən spesifik promotorla (RNT polimerazanın sintezinə başlayan nukleotidlərin ardıcıllığı) toxumaya xüsusi gücləndiricinin (“gücləndirici” ardıcıllıq) birləşməsi ilə müəyyən edilir. . Məlumdur ki, gen aktivliyi modulyasiya edilə bilər in vivo xarici siqnallar və gücləndiricilər istənilən genlə işləyə bildiyi üçün vektorlara izolyatorlar daxil edilə bilər ki, bu da gücləndiricinin mövqeyindən asılı olmayaraq işləməsinə kömək edir və genlər arasında funksional maneə kimi çıxış edə bilər. Hər bir gücləndirici aktivləşdirici və ya supressiv zülal amilləri üçün bir sıra bağlayıcı yerləri ehtiva edir. Promotorlar gen ifadə səviyyəsini tənzimləmək üçün də istifadə edilə bilər. Məsələn, metalotionin və ya temperatura həssas promotorlar var; hormonlar tərəfindən idarə olunan promotorlar.

Bir genin ifadəsi onun genomdakı mövqeyindən asılıdır. Əksər hallarda, mövcud viral üsullar yalnız bir genin təsadüfi olaraq genomuna daxil edilməsi ilə nəticələnir. Belə bir asılılığı aradan qaldırmaq üçün vektorlar qurularkən, gen məlum nukleotid ardıcıllığı ilə təmin edilir ki, bu da genomun hara daxil olmasından asılı olmayaraq genin ifadə olunmasına imkan verir.

Transgen ifadəsini tənzimləmənin ən sadə yolu onu qlükoza ifrazı və ya hipoksiya kimi fizioloji siqnala həssas olan göstərici promotorla təmin etməkdir. Belə "endogen" nəzarət sistemləri bəzi hallarda faydalı ola bilər, məsələn, insulin istehsalının qlükozadan asılı nəzarəti. "Ekzogen" nəzarət sistemləri, gen ifadəsi kiçik bir dərman molekulunun tətbiqi ilə farmakoloji olaraq idarə edildikdə daha etibarlı və universaldır. Hal-hazırda 4 əsas nəzarət sistemi məlumdur - tetrasiklin (Tet), həşərat steroidi, ekdizon və ya onun analoqları, antiprogestin preparatı mayfpriston (RU486) və rapamisin və onun analoqları kimi kimyəvi dimerizatorlar tərəfindən tənzimlənir. Onların hamısına transkripsiya aktivləşdirmə sahəsinin istənilən geni aparan əsas promotora dərmandan asılı cəlb edilməsi daxildir, lakin onlar bu cazibə mexanizmlərində fərqlənirlər. .

Nəticə

Məlumatların nəzərdən keçirilməsi belə bir nəticəyə gəlməyə imkan verir ki, dünyanın bir çox laboratoriyalarının səylərinə baxmayaraq, hər şey artıq məlum və sınaqdan keçirilmişdir. in vivo Və in vitro vektor sistemləri mükəmməl olmaqdan uzaqdır . Xarici DNT-nin çatdırılmasında problem yaranarsa in vitro praktiki olaraq həll edilir və müxtəlif toxumaların hədəf hüceyrələrinə çatdırılır in vivo uğurla həll olundu (əsasən müəyyən toxumalara xas olan antigenlər daxil olmaqla, reseptor zülallarını daşıyan konstruksiyalar yaratmaqla), sonra mövcud vektor sistemlərinin digər xüsusiyyətləri - inteqrasiyanın sabitliyi, tənzimlənən ifadə, təhlükəsizlik - hələ də ciddi təkmilləşdirmələr tələb edir.

Bu, ilk növbədə, inteqrasiyanın sabitliyinə aiddir. İndiyədək genomla inteqrasiya yalnız retroviral və ya adeno-əlaqəli vektorlardan istifadə etməklə həyata keçirilirdi. Stabil inteqrasiyanın səmərəliliyi reseptor vasitəçiliyi sistemləri kimi gen konstruksiyalarını təkmilləşdirməklə və ya kifayət qədər stabil epizomal vektorlar yaratmaqla (yəni nüvələr daxilində uzunmüddətli yerləşmə qabiliyyətinə malik DNT strukturları) artırıla bilər. Son zamanlar məməlilərin süni xromosomları əsasında vektorların yaradılmasına xüsusi diqqət yetirilir. Adi xromosomların əsas struktur elementlərinin olması səbəbindən belə mini-xromosomlar hüceyrələrdə uzun müddət saxlanılır və onların düzgün işləməsi üçün zəruri olan tam ölçülü (genomik) genləri və onların təbii tənzimləyici elementlərini daşıya bilirlər. genin, doğru toxumada və doğru zamanda.

Gen və hüceyrə terapiyası itirilmiş hüceyrələrin və toxumaların bərpası və orqanların gen mühəndisliyi dizaynı üçün parlaq perspektivlər açır ki, bu da şübhəsiz ki, biotibbi tədqiqat metodlarının arsenalını əhəmiyyətli dərəcədə genişləndirəcək və insan həyatının qorunması və uzadılması üçün yeni imkanlar yaradacaqdır.

30 avqust 2017-ci ildə ABŞ Qida və Dərman İdarəsi (FDA) qan xərçəngi üçün dünyada ilk gen terapiyasını təsdiqlədi. Bu, Novartis Pharmaceuticals şirkətinin Kymriah (tisagenlecleucel), CAR-T texnologiyasına əsaslanır və 25 yaşdan kiçik uşaqlarda və digər müalicələrə davamlı olmayan və ya digər müalicələrə davamlı olan gənc yetkin xəstələrdə B hüceyrəli kəskin limfoblastik leykemiyanın müalicəsi üçün nəzərdə tutulub. təkrarlanan xəstəlik.

CRISPR/Cas9 genomunun redaktəsi texnologiyasının istifadəsi gen terapiyasında yeni imkanlar açır. CRISPR/Cas9 hüceyrələrin DNT-sini çox dəqiq və təhlükəsiz şəkildə dəyişməyə imkan verir. Əgər siz CRISPR/Cas9 texnologiyasını adeno ilə əlaqəli viruslardan istifadə etməklə çatdırılma ilə birləşdirsəniz, bu, yəqin ki, orqanizmə sistemli təsir göstərməyə və çoxlu sayda hüceyrənin genomunu tamamilə təhlükəsiz şəkildə dəyişməyə imkan verəcək.

Və 2016-cı ildə Dyuk Universitetinin (ABŞ) genetikləri tarixdə ilk dəfə olaraq yetkin məməlidə (siçanlar) gen terapiyasını uğurla həyata keçirə bildiklərini və onu əzələ distrofiyası ilə əlaqəli genetik xəstəlikdən sağalda bildiklərini açıqladılar. Bunun üçün nisbətən yeni CRISPR/Cas9 gen redaktə texnologiyasının dəyişdirilmiş versiyasından istifadə edilib. CRISPR/Cas9 gen redaktə texnologiyası genetik materialın təyinat yerinə çatdırılmasına kömək etmək üçün adeno ilə əlaqəli virusun istifadəsini nəzərdə tutur. Bu texnologiyadan istifadə edərək, sınaq borularında və təkhüceyrəli embrionlarda ayrı-ayrı hüceyrələrin gen redaktəsi ilə bağlı uğurlu təcrübələr aparılıb. Təəssüf ki, insan embrionlarının genetik manipulyasiyası ehtimalı hələ də mübahisəlidir.

CRISPR/Cas bütün gözləntiləri aşdı. Bu, minimum sayda səhvlə həm lazımi genləri "söndürməyə", həm də genomun ciddi şəkildə müəyyən edilmiş bölgələrinə yeni genlər daxil etməyə imkan verdi.

2015-ci ilin dekabrında Feng Jang-ın elmi qrupu bu sistemi tamamilə səhvsiz hala gətirmək üçün dəyişdirdi və bu, aparıcı elmi jurnal Science-da dərc edildi. Elm adamları Cas9 endonükleazında zülalların meydana gəldiyi 3 amin turşusunu əvəz etdilər, bundan sonra belə bir sistemdəki səhvlərin sayı demək olar ki, sıfıra endirildi.

CRISP/Cas9-un istifadəsi xüsusilə yaşlanmanın gen terapiyası üçün aktualdır, burada bədənin əksər hüceyrələri üçün ümumi olan uzunömürlülük yollarına təsir etmək lazımdır. 2015-ci ilə qədər yaşlanma üçün gen terapiyası ilə bağlı insanlar üzərində heç bir klinik sınaq keçirilməmişdi, bu təəccüblü deyil, çünki yaşlanma hələ də xəstəlik kimi tanınmır.

Bundan əlavə, yaşlanma üçün gen terapiyası hələ də çox gənc və inkişaf edən bir sahədir. Hal-hazırda, yaşlanma üçün gen terapiyası ilə bağlı bütün tədqiqatlar model siçanlar, siçovullar, meymunlar və insan hüceyrə mədəniyyətləri - in vitro hüceyrələr üzərində aparılır.

Yaşlanmanın gen terapiyasına bütün yanaşmalar uzunömürlülük geninin bədənə çatdırıldığı və geni və ya qocalma yolunu “söndürən” kiçik RNT-lərin təqdim edildiyi yanaşmalara bölünür. Yəni birinci halda uzunömürlülük üçün faydalı bir şey təqdim edilir, ikincidə isə zərərli bir şey söndürülür. Düz mənada, 2015-ci ilə qədər məməlilərdə qocalmanın gen terapiyası ilə bağlı yalnız iki tədqiqat aparılmışdır.

Transgenik siçanlarda gen terapiyasını daha çox modelləşdirir. Bu cür tədqiqatlarda terapevtik gen yetkin siçanın bədəninə çatdırılmır, lakin gen mühəndisliyindən istifadə edərək, doğuşdan bəri genomu dəyişdirilmiş siçanlar yaradılır. Gen terapiyası kimi, müxtəlif genlərin aktivliyinin artırılması və ya azalmasının orqanizmin ömrünə və qocalmasına necə təsir etdiyini öyrənməyə imkan verir.

Gəlin gen terapiyası və genetik mühəndisliyin qocalma ilə mübarizədə nəzəri olaraq nə edə biləcəyinə baxaq.

Gen terapiyasının ömrü uzatmağın digər üsullarından üstünlüyü

Yaşlanma əleyhinə dərmanlardan (geroprotektorlar) istifadə edə biliriksə, nə üçün gen terapiyasına ehtiyacımız var? Ömrün uzadılmasına digər yanaşmalarla müqayisədə (məsələn, geroprotektorlar və ya qida məhdudiyyəti, ömrü 30-50% -ə qədər uzatmaq, gen terapiyasını ömür boyu yalnız bir dəfə aparmaq kifayətdir və həbləri hər zaman qəbul etmək və unutmamaq lazımdır - əks halda nəticə tam olmayacaq. Məsələn, Anjey Bartkenin 2001-ci ildəki əsərində Pəhrizin məhdudlaşdırılması siçanların ömrünü 30% uzadıb. Bununla belə, siçanlar ardıcıl 670 günə qədər aşağı kalorili pəhriz yedilər - bu, həyatlarının yarısı üçün hər gündür! Əksər insanlar üçün bu real deyil. Və 2012-ci ildə Maria Blasco-nun gen terapiyası təcrübəsində (bu məqalədə daha sonra müzakirə ediləcək) telomeraza gen terapiyası bir qədər kiçik təsirə səbəb oldu - siçanlar 20% daha uzun yaşamağa başladı. Ancaq bu işdə siçanlar kifayət qədər irəli yaşda bütün həyatları boyunca qana yalnız 1 dəfə dərman qəbul etdilər!

Buna görə də, ömrün uzadılmasına dair tədqiqatların insanlara tərcüməsindən danışırıqsa, gen terapiyasının mütləq üstünlüyü var, çünki daimi müalicə ehtiyacı səbəbindən həyat keyfiyyətini aşağı salmır - hər gün müəyyən bir pəhrizə riayət etmək və ya daim geroprotektorlar və ya digər dərmanlardan istifadə edin. Gen terapiyası da çox hədəflənmişdir və buna görə də daha az yan təsir potensialına malikdir.

Bundan əlavə, dərmanların müxtəlif toxuma və orqanlarda bioavailability məhdudiyyətləri var.

İki yaşlı vəhşi tip siçanlara (insan illərində 40-50 yaş) telomeraz geninin (TERT) bir dəfə inyeksiya ilə yeridilməsi telomerlərin uzunluğunu artırır və ömrünü 20% uzadır.

Alim hüceyrələrdə onların ümumi sayını məhdudlaşdıran müəyyən bölünmə sayğacının olduğunu təklif etdi. 10 il sonra rus alimi Aleksey Olovnikov bu sayğacın işləməsi üçün hipotetik mexanizm təklif etdi.

Olovnikov, hüceyrələr bölündükdə telomer adlanan xromosomların uclarının bir qədər qısaldığını irəli sürdü. Və telomerlər kritik uzunluğa çatdıqda hüceyrə bölünməyi dayandırır və qocalır. Daha sonra, Amerikalı sitogenetik Elizabeth Helen Blackburn, Carol Greider və Jack Shostak ilə birlikdə 2009-cu il üçün fiziologiya və ya tibb üzrə Nobel mükafatı laureatı oldu "telomerlər və telomeraz fermenti ilə xromosomların qorunması mexanizmlərinin kəşfinə görə" 1971-ci ildə Aleksey Olovnikov tərəfindən təklif edilən nəzəriyyə.

Yaşlanmayan hüceyrələrdə (məsələn, rüşeym və embrion kök hüceyrələr) əksinə, telomerləri uzadan, hüceyrələrin demək olar ki, qeyri-müəyyən müddətə bölünməsinə imkan verən bir ferment olmalıdır. Bundan əlavə, müəyyən edilmişdir ki, telomeraza geninin zədələnməsi model heyvanların ömrünü xeyli qısaldır və vaxtından əvvəl qocalma sindromunun - progeriyanın inkişafına səbəb olur.

Telomerazanın kəşfindən sonra onlarla alim onun əsasında qocalığın müalicəsini hazırlamaqda maraqlı oldu. Belə görünür ki, bütün hüceyrələrdə telomerazanı “yandırmaq” bədəni ölümsüz edə bilər. Bununla belə, telomerazanın aktiv sintezinin xərçəng şişlərinin 90%-də müşahidə olunduğuna görə tezliklə narahatlıqlar yarandı. Sual yarandı: telomerazanın aktivləşməsi bədxassəli transformasiya riskinə səbəb ola bilərmi?

Bundan əlavə, məlum oldu ki, hüceyrə qocalması həmişə telomerlərin qısalması ilə müşayiət olunmur. Məsələn, ağız mukozasının epitel hüceyrələri və ya insan gözünün buynuz qişası vəziyyətində. Bu, yalnız telomerazın aktivləşdirilməsinin bütün bədəni cavanlaşdırmaq üçün kifayət etmədiyini göstərir. Gen terapiyasına keçməzdən əvvəl transgen siçanlarda telomerazanın təsiri öyrənilmişdir. Məlum oldu ki, bütün siçan hüceyrələrində TERT genini "yandırsanız", ömür uzunluğu 40% artır! Bununla belə, davamlı telomeraz fəaliyyəti də xərçəng riskini artırır. Buna görə də, telomerazanı daha qısa müddət ərzində necə aktivləşdirmək barədə sual yarandı.

Bu, Maria Blasco-nun 2012-ci il məqaləsinin etdiyi şeydir (diaqrama bax). Telomeraza geni sistemli ötürmə qabiliyyətinə malik olan adeno-associated virus (AAV9) vasitəsilə siçan bədəninə çatdırılıb. Adeno ilə əlaqəli viruslar yüksək təhlükəsizlik ilə xarakterizə olunur: onlar çatdırılan geni ev sahibinin genomuna inteqrasiya etmirlər və buna görə də mutagenez (xərçəng riski yoxdur) aparmırlar. Bundan əlavə, onlar çətin ki, immunitet reaksiyasını tetikler. Eyni zamanda, TERT geni ilə terapiya tamamilə təhlükəsiz oldu: siçanlarda xərçəng riski artmadı. İki yaşlı siçanlara telomeraz geninin daxil edildiyi adenovirusla bir dəfə iynə vurulub. Bu, siçanların ömrünü 20% artırdı (yuxarıdakı qrafikdə göstərildiyi kimi). Və bu, nəzəri olaraq, 40-50 yaşlı insanlara belə bir dərmanı bir dəfə vurmağa və ömrünü daha 8-12 il uzatmağa imkan verə bilər.

Bu gün telomeraza dərmanlarla stimullaşdırıla bilər. Bu sahədə maraqlı araşdırma 2016-cı ildə Lyublyana Universitetinin (Sloveniya) alimləri tərəfindən valsartan və fluvastatinin aşağı dozaları ilə damarların cavanlaşdırılması üzrə bir sıra uğurlu klinik sınaqlardan sonra aparılıb. Bu dəfə onlar 130 xəstədən alınan qan nümunələrində damar cavanlaşmasından sonra telomeraza aktivliyini ölçdülər.

Beləliklə, bir aylıq kurs telomeraz fəaliyyətini əhəmiyyətli dərəcədə 3,28 dəfə artırır ki, bu da endotel funksiyasının yaxşılaşması (damar cavanlaşması) və qan damarlarında iltihabın azalması ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqələndirilir. Və bu artan telomeraz səviyyəsi daha altı ay davam edir, tədricən azalır. Ancaq telomerazın bu artımının telomerlərə nə dərəcədə təsirli olduğunu müəyyən etmək qalır.

Bilmək vacibdir ki, bu cür terapiya doğru zamanda və çox uzun müddət aparılmazsa, telomerlər həyatımızı mütləq uzada bilməz.

Bundan əlavə, telomeraz stimullaşdırılması tək başına telomerləri uzatmaya bilər. Telomeraza aktivliyi yaşla demək olar ki, dəyişməz olaraq qalır - soldakı qrafikə baxın. Ancaq telomerlər hələ də qısaldılır.

Həmçinin bu gün bazarda telomeraza aktivliyini artıran bir dərman var - TA-65. Bu, çox bahalıdır və tədqiqatlarda siçanların ömrünü heç bir şəkildə uzatdığı göstərilməmişdir. Soldakı qrafikə baxın. 2011-ci ildə aparılan bir araşdırmada İspaniya Milli Xərçəng Mərkəzinin alimləri əvvəlki tədqiqata bənzər telomerazanı artırmaq üçün uzunömürlü iki yaşlı siçanlara TA-65 verdilər. Yalnız əvvəlki tədqiqatda gen terapiyası üçün siçanlara inyeksiya edilmişdi. Lakin TA-65 dərmanı gen terapiyasından fərqli olaraq siçanların ömrünü heç bir şəkildə uzatmadı (soldakı qrafikə baxın) və ömrü uzatmaq və qocalmanı yavaşlatmaq üçün tamamilə yararsız olduğu ortaya çıxdı.

2011-ci ildə Texas Universitetinin alimləri 60-dan çox məməli növünün hüceyrə mədəniyyətlərində telomerlər və telomerazanı tədqiq ediblər. Uzunömürlülükdə telomerlərin rolu o qədər də aydın deyildi... Tədqiqatlar göstərir ki, (təxminən 60 növ məməlilər müqayisə edilərkən) bir növün telomerləri nə qədər uzun olarsa, DNT mutasiyaları bir o qədər tez toplanır, xərçəng şişləri bir o qədər çox olur və ömrü qısalır. . Telomer uzunluğu ömür uzunluğu ilə tərs əlaqədədir. Bu onu deməyə əsas verir ki, siçanlarda bir inyeksiya ilə əldə edilən telomerazanın ömrünü uzatan nəticəsi insanlarda ömrü uzatmaya bilər. Telomerlər məsələsi insanlar üçün açıq qalır.

Nəticə: Gələcəkdə nəzəri olaraq, telomeraz genini (TERT) 40-50 yaşlarında bir dəfə inyeksiya ilə təqdim etməklə telomerlərin uzunluğunu artıra biləcəyik, ancaq bu cür terapiyanın təkbaşına kifayət etmədiyi açıq-aydın. Ən tez, insan ömrünü əhəmiyyətli dərəcədə uzatmaq üçün gen terapiyası təsirlərinin birləşməsini tapmalıyıq. Bu gün dərmanların birləşməsi ilə altı ayda bir dəfə bir aylıq terapiyadan istifadə edərək təsiri təqlid edə bilərik valsartan 20 mq + fluvastatin 10-20 mq, və ya telmisartan + atorvastatin 10 mq.Ən azı bu dərmanlar birləşərək telomerazanın özünü stimullaşdırmağa qadirdir.

AT1a angiotenzin reseptorlarını kodlayan Agtr1a geninin pozulması transgen siçanların ömrünü vəhşi tipli siçanlarla müqayisədə 26% uzadır.

Angiotensin II reseptor antaqonistləri və ya AT1 reseptor blokerləri antihipertenziv dərmanların yeni qruplarından biridir (qan təzyiqinin müalicəsi üçün dərmanlar). Bu dərmanlara bütün dərmanlar daxildir sartan qrupları (məsələn, telmisartan).

Kaplan primatlardan nümunə götürərək göstərdi ki, bir qrup erkək primat toplasanız, bir neçə gün ərzində meymunlarda sosial iyerarxiya yaranacaq. Belə bir iyerarxiyada ən pis yer aşağıdadır. Tabe mövqelərdə olan kişi primatlar xroniki stressin bir sıra göstəricilərini nümayiş etdirirlər. Onlar tez-tez ateroskleroz inkişaf etdirirlər. Alimlər sosial iyerarxiyanın aşağı hissəsində (risk altında olan) erkək primatlara beta-bloker verdikdə propranolol, simpatik sinir sisteminin fəaliyyətini boğaraq, sonra damar aterosklerozu inkişaf etmədi.

Məlum olub ki, simpatik sinir sistemi stress səbəbindən aterosklerozun inkişafına mənfi təsir göstərir və ürək və qan damarları ilə bağlı problemlərə cəlb olunur. Emosional stress beynimizin və daxili orqanların idarəetmə mərkəzlərini birləşdirən simpatik (adrenergik) avtonom sinir sistemi vasitəsilə özünü həyata keçirir. O cümlədən immun, sümük iliyi və s. Ateroskleroz inkişaf etmiş ölkələrdə infarkt və beyin insultundan ən çox ölümə səbəb olan əsas amildir.

1983-cü ildə Goldstein S və digərləri tərəfindən randomizə edilmiş, ikiqat kor, plasebo ilə idarə olunan bir sınaq, terapiyanın propranolol kəskin miokard infarktı olan 3837 xəstədə ürək-damar xəstəliklərindən ölümü azaldır (dünyada 1 nömrəli ölüm səbəbi).

2017-ci ilin mart ayında fransız alimləri oraq hüceyrə xəstəliyinin müalicəsi üçün gen terapiyasının uğurlu klinik sınaqları haqqında məlumat verdilər.

Amerika Milli Elmlər Akademiyasının və Milli Tibb Akademiyasının bir komitəsi 2017-ci ildə insan embrionlarının genomunun redaktəsinə dəstək verdi. Ancaq yalnız ciddi xəstəliklər üçün və ciddi nəzarət altında.

nəticələr

1. Qocalmanın gen terapiyasına bütün yanaşmalar uzunömürlülük geninin orqanizmə çatdırıldığı və gen və ya yaşlanma yolunun “söndürüldüyü” yanaşmalara bölünür.

2. Ömrün uzadılmasına dair digər yanaşmalarla müqayisədə gen terapiyası ömür boyu yalnız bir dəfə aparılmalıdır.

3. Telomeraz geninin (TERT) tətbiqi, Agtr1a geninin pozulması, GHRKO nokautu, IGF-1 reseptorlarını kodlayan genlərin pozulması, FGF21-in həddindən artıq ifadəsi, AC5-in nokautu, RIP3-ün silinməsi, PCSK9 geninin overexpression Kholotunun redaktəsi, , RAGE-nin nokautu, BubR1-in həddindən artıq ifadəsi, MTH1-in həddindən artıq ifadəsi - bütün bunlar heyvanların ömrünü uzatmaq üçün gen mühəndisliyi və ya gen terapiyasının ən təsirli üsullarının nümunələridir.

4. Yaşlanma üçün gen terapiyasında və qocalmaya qarşı gen mühəndisliyində daha əhəmiyyətli nəticələr əldə etmək üçün müxtəlif yanaşmaları birləşdirmək lazımdır. Teqlər əlavə edin

Birinci hissə (mavi xəttdən əvvəl) gen terapiyasına girişdir, prinsipcə, metodların özlərini daha yaxşı başa düşmək və bir az, müəllim tərəfindən tutulmamaq üçün. Əgər vaxtınız yoxdursa və sualla bağlı XÜSUSİ materiala ehtiyacınız varsa, mavi xəttin yanından keçin.

Gen terapiyası əvvəlcə monogen irsi xəstəliklərin müalicəsinə yönəldildi, lakin sonra onun əhatə dairəsi genişləndi və o, yoluxucu xəstəliklər, xərçəng, ateroskleroz, diabet və bir sıra digər xəstəliklər də daxil olmaqla, bütün xəstəliklərin müalicəsi üçün potensial universal bir yanaşma kimi görünməyə başladı. .

"Gen müalicəsi"- gendə qüsurun korreksiyası (monogen xəstəliklər) - somatik və cinsi hüceyrələr səviyyəsində - mutant genin normal ilə əvəz edilməsi.

"Genlərlə müalicə"- tam hüquqlu işləyən genin (cDNA) tətbiqi ilə qüsurun düzəldilməsi.

Birincisi, bəzi ümumi nəzəriyyələr:

Uğurlu gen terapiyası üçün həlledici şərt səmərəli çatdırılmanın təmin edilməsidir, yəni. transfeksiyalar (geniş mənada) və ya transduksiya (viral vektorlardan istifadə edərkən) yad genin hədəf hüceyrələrə daxil edilməsi, onun bu hüceyrələrdə uzun müddət işləməsini təmin etmək və genin tam işləməsi üçün şərait yaratmaq (onun ifadəsi).

Genetik qüsurları düzəltmək üçün strategiyalar:

Vektor sisteminin növünə görə:

Viral

Viral vektorların üstünlükləri: çoxlu sayda hüceyrələrin ötürülməsi; tropizm; lizosomal deqradasiyaya qarşı müqavimət.

Viral vektorların çatışmazlıqları: immunogenlik (ölümcül nəticələrlə - adeno- və herpes virusları); potensial kanserogenlik (retroviruslar).

Viral olmayan

· Hüceyrəyə, toxumaya, orqana birbaşa inyeksiya (mikroinyeksiya kimi də tanınır);

Lipofection (müxtəlif dəyişdirilmiş lipozomlardan istifadə etməklə (içində DNT olan lipid veziküllər);

· Elektroporasiya;

· Tərkibində plazmid var;

· Mürəkkəb DNT (duzlar, zülallar və s. ilə birləşmiş plazmid DNT);

· Gen silahı (DNT xəstənin toxumasına atılan qızıl hissəciklərə yapışdırılır);

· Reseptor vasitəçiliyi ilə endositoz.

Viral olmayan çatdırılmanın üstünlükləri: nisbi təhlükəsizlik; immunitet reaksiyasının olmaması; istifadə rahatlığı.

Viral olmayan çatdırılmanın mənfi cəhətləri: aşağı transfeksiya səmərəliliyi; ifadənin aşağı səviyyəsi.

Nəzəri cəhətdən ən radikal və təsirli yol cinsi hüceyrələrdəki qüsurlu genin dəyişdirilməsidir (fetal gen terapiyası), lakin etik problemlər var. Hal-hazırda bütün gen terapiyası yanaşmaları somatik hüceyrələr səviyyəsində gen terapiyasına əsaslanır.

Daxil edilmiş genin və ya köçürülmüş DNT molekulunun təsir mexanizminə görə, gen terapiyası müsbət (gen funksiyasının bərpası (işinin bərpası və ya yeni iş nüsxəsinin daxil edilməsi yolu ilə) və ya mənfi - gen funksiyasının yatırılması) bölünür. Üstəlik, əsasən xərçəng gen terapiyasında istifadə olunan immun cavabın gücləndirilməsinə yönəlmiş bir yanaşma var (aşağıda bu barədə daha ətraflı).

Həmçinin, əvvəllər in vitro transformasiya olunmuş hüceyrələrinin bir hissəsi kimi insan orqanizminə yeni gen məlumatları daxil edilə bilər. ex vivo yanaşma. Gen məlumatının birbaşa canlı bir insanın hüceyrələrinə daxil olduğu yanaşma (birdən-birə) in vivo, müəyyən ərazilərə yerli in situ adlanır. Hal-hazırda, Böyük Britaniyada uterusda (embriona) gen məlumatının tətbiqi üçün uğurlu presedentlər var, ən son bir uşağı mitoxondrial xəstəlikdən xilas etdi.

Əlavə gen terapiyası yanaşmaları:

· Antisens DNT, RNT (+): spesifiklik, istənilən vektorda istifadə edilə bilər, qeyri-immunogen; (-): hüceyrədə sürətli deqradasiya);

· Ribozimlər (+): fermentlərin xassələrinə malikdir - onlar istehlak edilmir, hədəfin parçalanmasını kataliz etməyə qadirdir, zülallardan fərqli olaraq qeyri-immunogendir, interferon sintezini induksiya edir; (-): sürətli deqradasiya;

· Transdominant mənfi zülallar;

· Tək zəncirli antikorlar;

· İntihar genləri (hüceyrəni “müalicə etmək” əvəzinə onu sadəcə öldürmək olar, xərçəng əleyhinə sistemlərdə istifadə etmək olar (aşağıda daha ətraflı);

· Antigen spesifik lenfositlərin tətbiqi;

· Ximeroplastika (saç sancağı strukturunun DNT/RNT hibridləri, nüvədə homoloji rekombinasiya yaradır);

Burada yalnız gen terapiyası üsullarının nümunələri verilmişdir; xəstəliklərin təsviri üçün əvvəlki nömrələnmiş biletlərə baxın.

Monogen xəstəliklər:

Adenozin deaminaza çatışmazlığı(ADA sindromu) gen terapiyasından istifadənin ilk nisbətən uğurlu nümunəsidir. 1990-cı il sentyabrın 14-də həyata keçirilmişdir. Bu tarix əsl gen terapiyasının doğum günü hesab olunur.

Leykoforezdən istifadə edərək, mononükleer hüceyrələr periferik qandan təcrid olundu, sonra T-hüceyrələrinin yayılması şəraitində mədəniyyətdə yetişdirildi. Daha sonra normal ADA genini ehtiva edən retrovirus vektor in vitro proliferasiya edən hüceyrələrə daxil edilmişdir. Bir neçə gün sonra transduksiya edilmiş qan hüceyrələri yenidən xəstəyə yeridildi. Proses 10 ay ərzində 7 dəfə təkrarlandı. Təsir müsbət oldu, bədəndəki limfositlərin ¼ hissəsi işləyən gen aldı. Dəyişdirilmiş hüceyrələrin tətbiqi hər 3-5 aydan bir təkrarlandı. Hazırda bu xəstəlik üçün gen terapiyası xəstənin kök hüceyrələrindən istifadə istiqamətində hazırlanır. Bu, bədənin özündə artıq çoxlu bölünmələri səbəbindən dəyişdirilmiş hüceyrələrin enjeksiyonlarının sayını əhəmiyyətli dərəcədə azaldacaq və dəyişdirilmiş kök hüceyrələrin yerli olanlara nisbətən seçici və kəmiyyət üstünlüyünə nail olduqdan sonra bədəndə kifayət qədər ferment səviyyəsini formalaşdıracaqdır.

İrsi hiperkolesterolemiya - Məlumdur ki, bölünməyən hepatositlər retroviruslarla yoluxa bilməz. Hepatiktomiyadan sonra hepatositlər çoxalmağa başlayır və retroviruslarla yoluxma qabiliyyəti əldə edirlər. Normal LDL-R reseptor geninin cDNT-si retroviral vektordan istifadə etməklə xəstənin qaraciyərindən alınan hepatositlərə daxil edilmişdir. Rekombinant hepatositlərin portal vena vasitəsilə qaraciyərə reinfuziyasından sonra qanda aşağı sıxlıqlı lipoproteinlərin (xüsusən xolesterol) səviyyəsinin və aşağı sıxlıqlı lipoproteinlərin yüksək sıxlıqlı lipoproteinlərə nisbətinin azalması müşahidə edilmişdir. Bu o deməkdir ki, təqdim edilən hüceyrələr in vivo fəaliyyət göstərmiş və xolesterolu daxili və metabolizə etmişlər.

Hemofiliya B - Ex vivo strategiyasından istifadə edərək itlər üzərində uğurlu təcrübələr aparılmışdır
cDNA kodlayan faktor IX-un hepatositlərə çatdırılması. Qan plazmasında IX faktorun normal miqdarının 0,1%-ni təşkil edən miqdarda IX faktorun sintezinə nail olmaq mümkün olmuşdur. IX faktorun konsentrasiyasını artırmaq üçün adenoviral vektorlardan istifadə edildi, lakin təsir qısamüddətli oldu. Heyvanların qanı laxtalandı, lakin 2 aydan sonra təsir tamamilə yox oldu (adenoviral vektorların tipik çatışmazlığı).

Hemofiliya A - Retroviral vektorun bir hissəsi kimi siçanlara kəsilmiş faktor VIII geninin uğurla tətbiqi barədə məlumatlar var. Nəticədə qanda amilin terapevtik səviyyəsi əldə edilir.

Kistik fibroz - Göstərilmişdir ki, ağciyər epitel hüceyrələrinin 6-10%-nin transfeksiya edilmiş hüceyrələrlə əvəz edilməsi xlorid ionlarının daşınmasını təmin edən transmembran kanalların normal daşıma funksiyalarını bərpa edəcəkdir. Retroviruslar uyğun deyil, çünki onlar bölünməyən hüceyrələri yoluxdurmurlar; adenoviruslar siçanlar üzərində aparılan təcrübələrdə iltihablı reaksiyalara səbəb olduqları üçün ehtiyatla uyğun gəlir. Problem daha da hüceyrə səthindəki qlikokaliks baryerindədir. Bu problemi həll etmək üçün bir yanaşma, ağciyər epitel hüceyrələrinin səthində bir reseptor üçün xüsusi bir liqand ehtiva edən vektoru dəyişdirməkdir. Liqandın reseptorla qarşılıqlı təsiri adətən vektorun reseptorla birlikdə hüceyrəyə daxil olması ilə nəticələnir. Belə bir reseptor kimi transmembran reseptoru P2Y2-R seçilmişdir. Bu reseptor ağciyər boşluğunda iltihablı reaksiyaların kaskadını tetiklemede iştirak edir. Bu reseptor üçün monoklonal antikorlar və ya təbii liqand olan biotin UTP liqand kimi istifadə edilmişdir.

Duchenne əzələ distrofiyası - Xəstəlik uşaqlıqda özünü göstərməyə başlayır və gen terapiyası bu zaman aparılmalıdır. Ən perspektivli adenoviral vektorların istifadəsidir. Gen uzun olduğu üçün tədqiqatçılar zülalın qısaldılmış, lakin funksional surətlərindən istifadə edirlər. Qüsurlu distrofin geni olan siçan modellərində aparılan təcrübələr göstərdi ki, əzələ hüceyrələrinin 5-50%-i kəsilmiş distrofin zülalını ifadə edir. Bu, əzələ degenerasiyasını minimuma endirmək üçün kifayət idi. Duchenne əzələ distrofiyası olan xəstələrin müalicəsi üçün distrofin genini daşıyan genetik quruluşun klinik sınaqları haqqında məlumatlar var. Xəstə uşaqlar, bu dizaynın əzələlərinə inyeksiya edildikdən sonra hərəkət etmək qabiliyyətini əldə etdilər. Ancaq təsir qısamüddətli oldu.

Xərçəng nümunəsini istifadə edərək multifaktorial xəstəliklər:

Xərçəng ümumiyyətlə hüceyrədəki çox mərhələli dəyişikliklərin nəticəsidir. Çoxlu genlərin və onların məhsullarının şiş prosesinə cəlb olunması ilə bağlı mürəkkəblik xərçəng üçün gen terapiyasının effektivliyinə şübhələr yaradıb. Bununla belə, tək bir supressor genin kompensasiyasının hüceyrələrin şiş xüsusiyyətlərinin yatırılmasına səbəb ola biləcəyini göstərən çoxsaylı təcrübələr var.

Xərçəng immunoterapiyası:

İmmun (əsasən hüceyrə) antitümör reaksiyasını stimullaşdıran gen terapiyası konstruksiyalarının istifadəsi. Gen konstruksiyalarını yaratmaq üçün aşağıdakı genlərdən istifadə olunur: Antigenlər (immunitet sisteminin cavab verdiyi); MHCI kompleksi (əsas histouyğunluq kompleksi); amil B7; sitokinlər; T hüceyrə reseptorları. Şiş inkişafının yatırılmasına sitokinlər üçün genlərin klonlanması ilə nail olmaq olar: interleykinlər IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, həmçinin şiş nekrozu faktoru-α (TNF-α), interferonlar ( INF-α, INF-ϒ)

Xərçəng hüceyrələrinin böyüməsini onlara genlər daxil etməklə basdırmaq, məhsulları şiş inkişafını boğan:

Şiş supressor genləri (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyclin D)

· İntihar genləri

Onkogen inhibitorları

· Antiangiogenez faktorları

Siklin inhibitorları

· Şiş hüceyrələrinin dərman birləşmələrinə həssaslığını artıran genlər

· Dərman daşıyıcıları üçün genlər (məsələn, sümük iliyi hüceyrələrinə giriş)

P53 geni onkogenlərin basdırılmasında böyük əhəmiyyət kəsb edir (apoptozdan məsuldur və hüceyrə dövranını dayandırmağa qadirdir, nəzarətsiz bölünmənin qarşısını alır), buna görə də onun mutasiyası demək olar ki, həmişə hüceyrənin bədxassəli degenerasiyasına səbəb olur. Adenoviral vektorlar p53 geninin işləyən bir nüsxəsini bədənə daxil etmək üçün istifadə olunur. P53 geni xərçəng hüceyrəsinin nüvəsində ifadə olunmağa başladıqdan sonra onun apoptozuna səbəb olur.

Başqa bir yanaşma onkogenlərin basdırılması. RAS genindəki mutasiya, bölünmənin tetiklenmesi üçün siqnal sisteminin konstitutiv işləməsinə səbəb ola bilər (MAP kinaz kaskadı, Nikolaychik J-i xatırlayın). Bu geni bloklamaq üçün siz 1) bütöv bir gen təqdim etməklə RAS ifadəsini inhibə edə bilərsiniz; 2) RAS-ın ribozimlər tərəfindən inhibə edilməsi; 3) siqnal yolunda genlərin aşağı axınında inhibə edilməsi; 4) RAS zülalının membrana inteqrasiyasının qarşısının alınması.

Onkolitik virusların istifadəsi. Viral onkoliz virusların çoxaldıqları hüceyrələri öldürmək (lize etmək) təbii qabiliyyətinə əsaslanan xərçəngin müalicəsində prinsipcə yeni bir yanaşmadır. Bu məqsədlə reoviruslar, polioviruslar, exoviruslar və Coxsackie virusları + bəzi dəyişdirilmiş adenoviruslar istifadə olunur ki, onlar üstünlüklə şiş hüceyrələrində çoxalır və onları apoptoza aparır. Oncolytic Biotech tərəfindən istehsal olunan REOLYSIN-in klinik sınaqları hazırda davam edir. Antiangiogen zülalları ifadə edən adenoviruslar çox perspektivli hesab olunur.

Sağlamlıq

Qüsurlu genlərin sağlam genlərlə əvəz edilməsi konsepsiyası, keçən əsrin 90-cı illərinin əvvəllərində fəal şəkildə elmi qabıq almağa başladı, deyəsən, ən ümidsiz xəstələrə ümid verəcəkdi. Bununla belə, 1990-cı ildə aparılan gen terapiyası üzrə ilk təcrübədən bəri elm adamları arasında nikbinlik bir qədər azalıb - və bunların hamısı gen terapiyası üsullarının tətbiqində müəyyən uğursuzluqlar və çətinliklərlə əlaqədardır. Bununla belə, gen terapiyasının Parkinson xəstəliyi, kistik fibroz, müxtəlif xərçəng növləri və bir çox başqa xəstəliklərin müalicəsi üçün təklif etdiyi imkanlar həqiqətən sonsuzdur. Buna görə də alimlər yorulmadan çalışırlar, yol boyu ortaya çıxan gen terapiyası ilə bağlı bütün çətinlikləri aradan qaldırmağa çalışır.

Gen terapiyası nədir?

Bəs əslində gen terapiyası nədir? Bu suala cavab vermək üçün bunu xatırlatmaq lazımdır Bədənimizdəki genlərin əsas funksiyası zülalların istehsalını tənzimləməkdir, bütün hüceyrələrin normal işləməsi və sağlamlığı üçün lazımdır. Lakin bəzi genetik qüsurlar (genlərdəki qüsurlar) onların əsas funksiyalarına bu və ya digər dərəcədə mane olur, zülalların istehsalına mane olur. Gen terapiyasının (gen terapiyasının) məqsədi qüsurlu genləri sağlam genlərlə əvəz etmək. Bu, müvafiq zülalın reproduksiyasını qurmağa kömək edəcək, yəni insanın müəyyən bir xəstəlikdən sağalacağı deməkdir.

İdeal inkişaf ssenarisini nəzərə alsaq, hüceyrələrlə düzəldilmiş dezoksiribonuklein turşusu (DNT) molekulları bölünməyə başlayacaq, öz növbəsində korreksiya edilmiş genin çoxsaylı nüsxələrini istehsal edəcək, bu da orqanizmin genetik anormallıqdan qurtulmasına və tamamilə sağalmasına imkan verəcəkdir. Bununla belə, sağlam genlərin xəstə hüceyrələrə daxil edilməsi (həmçinin müvafiq anormallıqları düzəltməyə çalışmaq) son dərəcə mürəkkəb bir prosesdir. bu günə qədər nadir hallarda uğura gətirib çıxarmışdır. Buna görə də müasir tədqiqatların əksəriyyəti genlərin zədələnmiş hüceyrələrə daxil edilməsi üçün təhlükəsiz və etibarlı mexanizmlərin işlənib hazırlanmasına yönəlib.

Gen terapiyasının növləri: ex vivo və in vivo terapiya

Gen terapiyası, DNT-nin xəstənin genomuna daxil edilməsi üsulundan asılı olaraq həyata keçirilə bilər ya hüceyrə mədəniyyətində (ex vivo) və ya birbaşa bədəndə (in vivo). Ex vivo gen terapiyası ilə hüceyrələr xəstənin bədənindən çıxarılır, geni dəyişdirilir və daha sonra fərdin bədəninə yenidən daxil edilir. Bu üsul qan xəstəliklərinin müalicəsində xüsusilə faydalıdır, çünki qan hüceyrələri asanlıqla çıxarıla və yenidən daxil edilə bilər. Ancaq digər xəstəliklərin əksəriyyətində hüceyrələri bədəndən çıxarmaq və onları geri qaytarmaq o qədər də sadə deyil. Məsələn, genetik səbəblərdən yaranan ürək xəstəlikləri halında, təsirli bir tədbir, gen dəyişiklikləri birbaşa xəstənin bədənində aparıldığı zaman in vivo gen terapiyası adlanır. Bu proseduru yerinə yetirmək üçün genetik məlumat birbaşa vektor - nuklein turşusu molekulu vasitəsilə hüceyrəyə çatdırılır. genetik materialın ötürülməsi üçün gen mühəndisliyində istifadə olunur. Əksər hallarda bu ötürülməni həyata keçirmək üçün tədqiqatçılar sağlamlıq və həyat üçün təhlükəli olmayan viruslardan istifadə edirlər.

Genetik məlumatın hüceyrəyə çatdırılması üsulları

Çoxsaylı tədqiqatların göstərdiyi kimi, müxtəlif virusların istifadəsi çox təsirli bir həlldir, bədənin immun müdafiəsindən keçməyə imkan verir, və sonra virusu yaymaq üçün istifadə edərək hüceyrələri yoluxdurur. Bu proseduru həyata keçirmək üçün gen mühəndisləri retroviruslar və adenoviruslar qrupundan ən uyğun virusları seçiblər. Retroviruslar genetik məlumatı DNT-də saxlanılan genetik məlumatı emal etməyə kömək edən DNT-yə bənzər bir molekul olan ribonuklein turşusu (RNT) şəklində təqdim edir. Hədəf hüceyrə adlandırılan hüceyrəyə dərindən nüfuz etmək mümkün olan kimi, RNT molekulundan DNT molekulunun bir nüsxəsi əldə edilir. Bu proses əks transkripsiya adlanır. Hüceyrəyə yeni bir DNT molekulu bağlandıqdan sonra, hüceyrələrin bütün yeni nüsxələrində bu dəyişdirilmiş gen olacaq.

Adenoviruslar genetik məlumatı birbaşa DNT şəklində daşıyır və bölünməyən hüceyrəyə çatdırılır. Baxmayaraq ki bu viruslar DNT-ni birbaşa hədəf hüceyrənin nüvəsinə çatdırır, DNT hüceyrənin genomuna uyğun gəlmir. Beləliklə, dəyişdirilmiş gen və genetik məlumat qız hüceyrələrə ötürülmür. Adenoviruslardan istifadə etməklə aparılan gen terapiyasının üstünlüyü ondan ibarətdir ki, genləri vektor vasitəsilə yenə sinir sisteminin hüceyrələrinə və tənəffüs yollarının selikli qişasına daxil etmək mümkündür. Bundan əlavə, adeno ilə əlaqəli viruslar vasitəsilə həyata keçirilən üçüncü gen terapiyası üsulu var. Bu viruslar ehtiva edir nisbətən az miqdarda genetik məlumat, və retroviruslar və adenoviruslardan daha çətin aradan qaldırılır. Bununla belə, adeno ilə əlaqəli virusların üstünlüyü ondan ibarətdir ki, onlar insan immun sistemindən reaksiya vermirlər.

Gen terapiyasında viruslardan istifadə edərkən çətinliklər

Genetik məlumatın viruslar vasitəsilə hüceyrəyə çatdırılması üsulu ilə bağlı əsas problem ondan ibarətdir ki genlərin hədəf hüceyrə ilə əlaqəsini tamamilə idarə etmək olduqca çətindir. Bu, son dərəcə təhlükəli ola bilər, çünki sağlam hüceyrələri xərçəng hüceyrələrinə çevirə bilən sözdə gen ifadəsi istisna edilə bilməz. Bu zaman retroviruslarla işləyərkən bu problem xüsusilə aktuallaşır. İkinci problem həllini təşkil etmək hələ mümkün olmayan, gen terapiyasından istifadənin bir proseduru çox vaxt kifayət deyil. Əksər genetik müalicələrin vaxtaşırı təkrarlanması lazımdır. Üçüncüsü, genetik məlumatı hüceyrəyə çatdırmaq üçün virusların istifadəsi bədənin immun sistemindən reaksiya riski ilə çətinləşir. Bu da xüsusilə olduğu hallarda son dərəcə ciddi bir problemdir gen terapiyası prosedurunun bir neçə dəfə təkrarlanması tələb olunduqda, xəstənin bədəni tədricən uyğunlaşır və yeridilmiş viruslarla daha effektiv mübarizə aparmağa başlayır.

Gen terapiyası: tədqiqatlar davam edir

Uğurlardan danışırıqsa, bu zaman genetik terapiya son dərəcə təsirli bir tədbirdir qondarma birləşmiş immun çatışmazlığının müalicəsində, X xromosom geninə bağlıdır. Digər tərəfdən, bu xəstəliyin müalicəsi üçün gen terapiyasından uğurla istifadə halları çox azdır. Bundan əlavə, müalicənin özü risklidir, çünki bu, xəstələrdə leykemiyadan əziyyət çəkən insanlarda tez-tez rast gəlinən bir sıra simptomların yaşanmasına səbəb ola bilər. Bu xəstəlikdən başqa, gen terapiyasının çox, çox az halları var ki, bu qədər təsirli olacaq. baxmayaraq ki, son tədqiqatlar gen terapiyasının erkən istifadəsinə ümid verir artrit, beyin xərçəngi, oraq hüceyrə xəstəliyi, yarıq torlu qişa və bəzi digər xəstəliklərdən əziyyət çəkən xəstələrin müalicəsi üçün.

Belə çıxır ki, gen terapiyasının təbabətdə praktiki tətbiqindən danışmaq hələ çox tezdir. Buna baxmayaraq, Tədqiqatçılar gen terapiyasından təhlükəsiz və effektiv istifadə yollarını axtarmağa davam edirlər, təcrübələrin əksəriyyətini bədəndən süni xarici mühitə köçürən canlı toxumada həyata keçirərək. Bu təcrübələr arasında elm adamlarının süni, 47-ci xromosomu hədəf hüceyrəyə daxil etməyə çalışdıqları tədqiqatlar olduqca maraqlıdır. Son elmi araşdırmalar alimlərə prosesləri daha yaxşı başa düşməyə imkan verdi bir RNT molekulunun tətbiqi zamanı baş verir. Bu, Hamilton xəstəliyinin müalicəsində faydalı ola biləcək gen transkripsiyasını (genin bağlanması adlanır) boğmaq üçün bir mexanizmin inkişafına imkan verdi. Alimlər həmçinin əvvəllər vektordan istifadə etməklə edilə bilməyən genetik məlumatı beyin hüceyrələrinə çatdırmaq üçün bir üsul hazırlaya bildiklərini də bildirirlər. çünki bu molekul bu məqsəd üçün çox böyük idi. Başqa sözlə, araşdırmalar davam edir, bu isə o deməkdir ki, bəşəriyyətin gen terapiyası üsullarından istifadə etməklə xəstəliklərlə necə mübarizə aparacağını öyrənmək üçün hər cür şans var.