वेक्टर जीन स्थानांतरण. जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए एडेनोवायरल वैक्टर

• 1. रेट्रोवायरस पर आधारित वेक्टर;
• 2. एचआईवी वायरस (लेंटिवायरस) पर आधारित वेक्टर;
• 3. एडेनोवायरस पर आधारित वेक्टर;
• 4. एडेनो-जुड़े वायरस पर आधारित वेक्टर;
• 5. हर्पीस वायरस पर आधारित रोगवाहक।

रेट्रोवायरस-आधारित वैक्टर

ये छोटे आरएनए वायरस हैं जो केवल विभाजित कोशिकाओं को ही संक्रमित कर सकते हैं जिनमें वे प्रजनन करते हैं। वायरल जीनोम (प्रोवायरस के रूप में) लक्ष्य कोशिका के डीएनए में एकीकृत होता है। इसलिए, रेट्रोवायरल वैक्टर सैद्धांतिक रूप से कुछ प्रकार की कोशिकाओं में ट्रांसजीन की दीर्घकालिक अभिव्यक्ति प्रदान करने में सक्षम हैं। अधिकांश रेट्रोवायरल वैक्टर मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस से प्राप्त होते हैं। संक्रमित कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति से बचने के लिए वायरस के जीनोम को संशोधित किया जाता है, जिससे उन कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विकास को रोका जा सकता है। क्योंकि ये वायरस केवल विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं, रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग मुख्य रूप से पूर्व विवो सेल ट्रांसफ़ेक्शन या घातक बीमारियों के प्रायोगिक उपचार के लिए किया जाता है।

जीवन चक्र . रेट्रोवायरस के जीनोम में आरएनए का प्लस स्ट्रैंड होता है। रेट्रोवायरस का आवरण एक संक्रमित कोशिका की झिल्ली से बनता है और इसमें वायरल प्रोटीन होते हैं। जीनोम प्रतिकृति और वायरस असेंबली के लिए तीन वायरल जीन की आवश्यकता होती है: गैग, पोल और एनवी। एक संक्रमित कोशिका में, वायरल आरएनए टेम्पलेट पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा, डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए (प्रोवायरस) बनता है, जिसे बाद में सेलुलर जीनोम में एकीकृत किया जाता है। यह वायरल प्रोटीन - रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और इंटीग्रेज द्वारा प्रदान किया जाता है। प्रोवायरस के नाभिक में प्रवेश के लिए, कोशिका की नाभिकीय झिल्ली का विनाश आवश्यक है, जो माइटोसिस के दौरान होता है। सेलुलर जीनोम में एकीकृत प्रोवायरस वायरल एमआरएनए के प्रतिलेखन, उनके प्रसंस्करण और अनुवाद के लिए सेल तंत्र का उपयोग करता है। वायरस का जीवन चक्र प्रोवायरस मैट्रिक्स पर नए आरएनए प्लस स्ट्रैंड के संश्लेषण के साथ समाप्त होता है। आरएनए अणु (पीएसआई) में एक विशिष्ट अनुक्रम असेंबली सिग्नल देता है, जिसके बाद कोशिका की सतह से नए वायरस निकलते हैं।

रेट्रोवायरल वेक्टर का उपयोग. A. रेट्रोवायरल वेक्टर प्राप्त करने की योजना। बी. आरएनए युक्त रेट्रोवायरल वेक्टर की शुरूआत के बाद लक्ष्य कोशिका में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति

चित्र 1 का विवरण। ए. रेट्रोवायरल वेक्टर प्राप्त करने की योजना। रेट्रोवायरल वैक्टर प्राप्त करने के लिए जो प्रजनन में सक्षम नहीं हैं, विशेष सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है जो उन वायरल प्रोटीन को संश्लेषित करने में सक्षम होते हैं जिनके जीन वेक्टर निर्माण के दौरान हटा दिए जाते हैं। गैग (जी), पोल (पी) और एनवी (ई) जीन को बैक्टीरिया प्लास्मिड का उपयोग करके एक उपयुक्त लाइन की कोशिकाओं (उदाहरण के लिए, मानव भ्रूण की किडनी कोशिकाएं) में पेश किया जाता है। कोशिकाएं जो संबंधित वायरल प्रोटीन को संश्लेषित करती हैं उन्हें पैकेजिंग कोशिकाएं कहा जाता है। फिर पुनः संयोजक प्रोवायरल डीएनए युक्त एक प्लास्मिड, जिसमें गैग, पोल और एनवी जीन के बजाय वांछित ट्रांसजीन स्थित होता है, का उपयोग पैकेजिंग कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं में अब वायरस को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक सभी चीजें शामिल हैं, और रेट्रोवायरल वैक्टर संस्कृति माध्यम में जमा होने लगते हैं। इन वैक्टरों में एक ट्रांसजीन होता है, लेकिन वायरल जीन गैग, पोल और एनवी की कमी होती है, और इसलिए अगली कोशिका को संक्रमित करते समय पुन: पेश नहीं किया जा सकता है। बी. आरएनए युक्त रेट्रोवायरल वेक्टर की शुरूआत के बाद लक्ष्य कोशिका में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति।

वेक्टर का निर्माण और प्राप्ति. रेट्रोवायरल वैक्टर संबंधित प्रोवायरस से प्राप्त होते हैं। नई आनुवंशिक सामग्री के लिए जगह बनाने और वायरस को पुन: उत्पन्न होने से रोकने के लिए गैग, पोल और एनवी जीन को हटा दिया जाता है (चित्र 1)। एक रेट्रोवायरल वेक्टर में विदेशी डीएनए के 8,000 न्यूक्लियोटाइड जोड़े तक हो सकते हैं। चूंकि पुनः संयोजक वायरस वायरल एमआरएनए को संश्लेषित नहीं कर सकता है, इसलिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन के संश्लेषण की कमी होती है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर कर सकता है। उपचार के लिए इच्छित जीन के साथ, एक प्रमोटर और एन्हांसर-सेर को वेक्टर में पेश किया जा सकता है, जो ट्रांसजीन की प्रभावी अभिव्यक्ति सुनिश्चित करता है और, कुछ मामलों में, इसकी ऊतक विशिष्टता सुनिश्चित करता है। लॉन्ग टर्मिनल रिपीट (एलटीआर) क्षेत्र में स्थित एक वायरल प्रमोटर और एन्हांसर का भी उपयोग किया जा सकता है।

वायरल प्रोटीन को एन्कोड करने वाले जीन को हटाने और वायरस के प्रजनन को सुनिश्चित करने के बाद, वायरस केवल पैकेजिंग कोशिकाओं की विशेष रूप से बनाई गई लाइनों में प्रजनन करने में सक्षम होता है जो इन प्रोटीनों को संश्लेषित करते हैं (चित्र 1)। वायरल जीन (गैग, पोल और एनवी) को इन कोशिकाओं के जीनोम में डाला जाता है ताकि वे विभिन्न गुणसूत्रों पर स्थित हों। इससे इन जीनों के मूल वायरल जीनोम में पुनः संयोजित होने और प्रजनन में सक्षम वायरस बनाने की संभावना कम हो जाती है। पुनः संयोजक प्रोवायरल डीएनए को पैकेजिंग कोशिकाओं में पेश करने के बाद, बाद वाले एक रेट्रोवायरल वेक्टर का उत्पादन शुरू करते हैं। प्रोवायरल डीएनए को एक प्लास्मिड के रूप में पेश किया जाता है, जिसमें गैग जीन का एक छोटा क्षेत्र असेंबली सिग्नल और विदेशी जीन के साथ दो लंबे टर्मिनल रिपीट के बीच संलग्न होता है। पैकेजिंग कोशिकाओं का अभिकर्मक एक मानक विधि का उपयोग करके किया जाता है। पुनरुत्पादन में सक्षम वायरस बनाने के लिए पुनर्संयोजन की संभावना को कम करने के लिए इस दृष्टिकोण के कई संशोधन विकसित किए गए हैं।

लक्षित कोशिका। किसी वायरस की कुछ प्रकार की कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से संक्रमित करने की क्षमता काफी हद तक वायरस के बाहरी आवरण के प्रोटीन (एनवी जीन द्वारा एन्कोड किए गए रेट्रोवायरस में) और संबंधित कोशिका झिल्ली रिसेप्टर के बीच बातचीत से निर्धारित होती है। मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस इकोट्रोपिक है, जिसका अर्थ है कि यह केवल माउस कोशिकाओं को संक्रमित करता है। लक्ष्य कोशिकाओं की सीमा का विस्तार करने के लिए, म्यूरिन ल्यूकेमिया वायरस के स्ट्रेन 4070ए के एनवी जीन का उपयोग किया जाता है। यह स्ट्रेन एम्फोट्रोपिक है और न केवल चूहों, बल्कि मनुष्यों सहित अन्य स्तनधारियों की कोशिकाओं को भी संक्रमित करता है। स्यूडोटाइपिंग, यानी वायरल जीनोम को किसी अन्य वायरस के प्रोटीन वाले लिफाफे में पैक करना, लक्ष्य कोशिकाओं की सीमा का विस्तार करना संभव बनाता है। उदाहरण के लिए, वेसिकुलर स्टामाटाइटिस वायरस ग्लाइकोप्रोटीन जिसे जी प्रोटीन कहा जाता है, मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस के आवरण में आसानी से शामिल हो जाता है। इस प्रोटीन की उपस्थिति लक्ष्य कोशिकाओं की सीमा का विस्तार करती है और संक्रमण को सुविधाजनक बनाती है। इसके अलावा, जी प्रोटीन को शामिल करने से रेट्रोवायरल वेक्टर की स्थिरता बढ़ जाती है और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान वायरस का उच्च टिटर प्राप्त करना संभव हो जाता है। जी प्रोटीन का नुकसान पैकेजिंग कोशिकाओं के लिए इसकी विषाक्तता है। प्रेरक जी प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ पैकेजिंग कोशिकाओं का उपयोग करके इस नुकसान को आंशिक रूप से दूर किया जा सकता है। रेट्रोवायरल वैक्टर जिनमें अन्य वायरल प्रोटीन होते हैं, जैसे गिब्बन ल्यूकेमिया वायरस या लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिनजाइटिस वायरस प्रोटीन, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए कम विषैले होते हैं।

आवेदन पत्र। रेट्रोवायरल वैक्टर की मदद से, रोगी कोशिकाओं को आमतौर पर पूर्व-जीवित ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है या वैक्टर को सीधे ऊतकों में पेश किया जाता है। पहले दृष्टिकोण में रोगी की कोशिकाओं को अलग करना और उन्हें संस्कृति में बनाए रखना, कोशिकाओं को रेट्रोवायरल वेक्टर से संक्रमित करना और फिर कोशिकाओं को रोगी में इंजेक्ट करना आवश्यक है। इस तरह उन्होंने एडेनोसिन डेमिनमिनस की कमी और पारिवारिक हाइपरकोलेस्ट्रोलेमिया के साथ लिम्फोसाइट्स और हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं को संशोधित करने का प्रयास किया। ट्यूमर कोशिकाओं में इम्युनोमोड्यूलेटर की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए इसी तरह की प्रक्रिया का पालन किया गया था। मुख्य रूप से ठोस ट्यूमर के इलाज के लिए रेट्रोवायरल वैक्टर के सीधे इंजेक्शन का प्रयास किया गया है।

सुरक्षा। चूंकि वायरस को सेलुलर जीनोम (जो दीर्घकालिक अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है) में डाला जाता है, और यादृच्छिक रूप से, उत्परिवर्तन (सम्मिलित उत्परिवर्तन) का खतरा होता है। उदाहरण के लिए, वायरस डालने से कोशिका विभाजन को नियंत्रित करने वाले जीन का कार्य बदल सकता है, जिससे अवांछनीय परिणाम हो सकते हैं। प्रजनन में सक्षम रेट्रोवायरस में कुछ कैंसरजन्यता होती है, लेकिन यह उन रेट्रोवायरल वैक्टरों में नहीं देखा जाता है जिनमें इस क्षमता की कमी होती है।

"जैव प्रौद्योगिकी। जेनेटिक इंजीनियरिंग। जीन थेरेपी" विषय की सामग्री तालिका:
1. जैवप्रौद्योगिकी. विज्ञान जैव प्रौद्योगिकी. जैव प्रौद्योगिकी विकास के चरण.
2. जैव प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के क्षेत्र। जैव प्रौद्योगिकी के उपयोग के क्षेत्र. जैव प्रौद्योगिकी में सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रक्रियाओं का अनुकूलन।
3. सूक्ष्मजीवों का औद्योगिक उपयोग। माइक्रोबियल संश्लेषण उत्पादों का उत्पादन। एंटीबायोटिक दवाओं का उत्पादन. वैक्सीन उत्पादन.
4. जेनेटिक इंजीनियरिंग. जैव सुरक्षा. जेनेटिक इंजीनियरिंग की प्रासंगिकता. जेनेटिक इंजीनियरिंग का सैद्धांतिक आधार.
5. कोशिका में आनुवंशिक सामग्री का संगठन। जीनोटाइप. जेनेटिक इंजीनियरिंग क्या है? जीन उत्पाद प्राप्त करने के चरण।
6. जेनेटिक इंजीनियरिंग विधियों का अनुप्रयोग। जेनेटिक इंजीनियरिंग के उपयोग के लिए संकेत (औचित्य)। जेनेटिक इंजीनियरिंग का उपयोग करने के कारण.
7. जेनेटिक इंजीनियरिंग में जैव सुरक्षा। जैव सुरक्षा को विनियमित करने वाले दस्तावेज़।
8. सूक्ष्मजीवों के खतरे समूह। आनुवंशिक रूप से संशोधित सूक्ष्मजीवों के उपयोग का जोखिम मूल्यांकन।
9. जीन डायग्नोस्टिक्स। पित्रैक उपचार। जीन डायग्नोस्टिक्स और जीन थेरेपी क्या है? जीन थेरेपी के प्रकार.
10. वेक्टर. आरएनए वायरस पर आधारित वेक्टर। डीएनए जीनोमिक वायरस पर आधारित वेक्टर। गैर-वायरल वैक्टर.
11. जीन थेरेपी की संभावनाएँ। जीन थेरेपी का भविष्य. जीन थेरेपी के उद्देश्य.

सदिश. आरएनए वायरस पर आधारित वेक्टर। डीएनए जीनोमिक वायरस पर आधारित वेक्टर। गैर-वायरल वैक्टर.

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, संबंधित जीन को कोशिका में स्थानांतरित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जाता है। वैक्टर[अक्षांश से. वेक्टर, वाहक]। उनके विकास में मुख्य समस्या प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षात्मक बाधा पर काबू पाना है, जो शरीर को कोशिका जीनोम में विदेशी डीएनए की शुरूआत सहित विभिन्न बाहरी प्रभावों से बचाता है। इस संबंध में, वायरस विशेष रुचि रखते हैं, क्योंकि सभी ज्ञात एजेंटों में से केवल वे ही हैं जो आनुवंशिक सामग्री को मानव कोशिकाओं के जीनोम में कम या ज्यादा सफलतापूर्वक एकीकृत करने में सक्षम हैं। इसलिए, जीन थेरेपी विशेषज्ञों के सभी प्रयास वर्तमान में वैक्टर के रूप में उपयोग किए जाने वाले वायरस की आनुवंशिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में केंद्रित हैं जो रोगी के शरीर की कोशिकाओं में चिकित्सीय जीन पहुंचाते हैं।

आरएनए वायरस वैक्टर

आरएनए जीनोमिक वायरसआसानी से मेजबान कोशिका के जीनोम में एकीकृत हो जाता है, जिससे आवश्यक जीन की दीर्घकालिक अभिव्यक्ति सुनिश्चित होती है। जीन थेरेपी वैक्टर बनाने के लिए रेट्रोवायरस सबसे आशाजनक हैं। उनकी भागीदारी से, जीन थेरेपी के सभी नैदानिक ​​प्रयासों में से लगभग 60% को पूरा किया गया है।

रेट्रोवायरसनिस्संदेह, एचआईवी और मानव टी-लिम्फोट्रोपिक वायरस को छोड़कर, यह मनुष्यों के लिए अपेक्षाकृत हानिरहित है। सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला वेक्टर मुरीन ल्यूकेमिया वायरस है। वैक्टर विकसित करते समय, उत्पादों के संश्लेषण को एन्कोड करने वाले जीन जो प्रजनन सुनिश्चित करते हैं, उन्हें उनकी संरचना से पूरी तरह से बाहर रखा जाता है। रेट्रोवायरल वैक्टर में ट्रांसजीन की कोडिंग क्षमता 8000 न्यूक्लिक एसिड बेस जोड़े से अधिक नहीं होती है।

मुख्य अनुप्रयोग समस्याएँ आरएनए वायरल वैक्टर- कोशिकाओं में आनुवंशिक सामग्री की कुशल डिलीवरी, दीर्घकालिक अभिव्यक्ति का समर्थन और गैर-विभाजित कोशिकाओं का पारगमन (अधिकांश आरएनए वैक्टर आराम करने वाली कोशिकाओं में ट्रांसजेन के कुशल हस्तांतरण में असमर्थ हैं)। हालाँकि, किसी विशेष स्थिति में आराम कर रही कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने में रेट्रोवायरस की अक्षमता भी फायदेमंद हो सकती है, उदाहरण के लिए, ग्लियोब्लास्टोमा (घातक मस्तिष्क ट्यूमर) के लिए जीन थेरेपी में। उनके उपयोग का विचार घाव में विभाजित कोशिकाओं का चयनात्मक पारगमन है - ट्यूमर कोशिकाएं और संवहनी कोशिकाएं; तंत्रिका कोशिकाएं विभाजित नहीं होती हैं और इसलिए रेट्रोवायरल वैक्टर के लिए लक्ष्य के रूप में काम नहीं करती हैं।

डीएनए जीनोमिक वायरस पर आधारित वेक्टर

वैक्टर, के आधार पर बनाया गया है डीएनए वायरसवे आरएनए जीनोमिक वायरस की तुलना में आकार में बड़े होते हैं और इसलिए लंबाई में 35,000 बेस जोड़े तक डीएनए टुकड़े (ट्रांसजेन) को समायोजित कर सकते हैं।

एडेनोवायरल वैक्टर. सिस्टिक फाइब्रोसिस और घातक ट्यूमर के सीटू जीन थेरेपी के लिए एडेनोवायरस-आधारित वैक्टर बनाए जा रहे हैं। एडेनोवायरल वैक्टर गैर-विभाजित कोशिकाओं सहित मानव कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के अत्यधिक कुशल पारगमन में सक्षम हैं। एडेनो-संबद्ध वायरस पर आधारित वेक्टर विशेष ध्यान देने योग्य हैं। एडेनो-एसोसिएटेड वायरस एक गैर-रोगजनक वायरस है जो मनुष्यों में व्यापक है (एटी से इसका एजी 80% लोगों में पाया जाता है)। वायरस जीनोम के एक निश्चित हिस्से में ट्रोपिक है; यह मुख्य रूप से क्रोमोसोम 19 की छोटी भुजा के साथ एकीकृत होता है। प्रयोगों ने मस्तिष्क, कंकाल की मांसपेशियों और कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने में एडेनो-जुड़े वायरस के आधार पर बनाए गए वैक्टर की प्रभावशीलता दिखाई है। जिगर।

अन्य डीएनए जीनोमिक वायरस. अन्य डीएनए युक्त वायरस में, हर्पीस सिम्प्लेक्स वायरस (एचएसवी), जो तंत्रिका ऊतक के लिए ट्रॉपिज़्म प्रदर्शित करता है (तदनुसार, मस्तिष्क कोशिकाओं के पारगमन के लिए उपयोग किया जाता है), अपेक्षाकृत अक्सर उपयोग किया जाता है।

गैर-वायरल वैक्टर

गैर-वायरल वैक्टर(ट्रांसपोसॉन या सम्मिलन अनुक्रम गुणों वाले डीएनए अणु) वायरस-आधारित वैक्टर की तुलना में कम आम हैं। हालाँकि, गैर-वायरल वैक्टर कई फायदे प्रदान करते हैं, जैसे सुरक्षा और निर्माण में आसानी। कोशिकाओं में जीन पहुंचाने के लिए एक सिंथेटिक प्रणाली का निर्माण करके, पुनः संयोजक वायरस या अन्य विषाक्त प्रभाव पैदा करने के खतरे से बचा जा सकता है।

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रेट्रोवायरल वैक्टर

200 से अधिक रोगियों से जुड़े नैदानिक ​​​​परीक्षणों के अनुभव से पता चलता है कि प्रतिकृति-दोषपूर्ण रेट्रोवायरल वैक्टर किसी भी प्रतिकूल दुष्प्रभाव का कारण नहीं बनते हैं। फिर भी, उनके उपयोग की सुरक्षा को बहुत महत्व दिया जा रहा है। प्लाज़्मावायरस नामक एक संरचना बनाई गई है जिसमें रेट्रोवायरल जीन शामिल हैं झूठऔर पोह 5"-LTR-npoMOTopa, साथ ही एक "चिकित्सीय" जीन और एक जीन के नियंत्रण में पर्यावरण,साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर द्वारा संचालित। अभिकर्मक के बाद, प्लाज़्मावायरस प्रतिकृति-दोषपूर्ण वायरल कणों के निर्माण को ट्रिगर करता है, और प्रतिकृति-सक्षम रेट्रोवायरस बनाने के लिए पुनर्संयोजन की संभावना बहुत कम है। वेक्टर 3.5 केबी से अधिक नहीं ले जा सकता है। डीएनए, लेकिन अधिकांश संभावित "चिकित्सीय" सीडीएनए और ट्यूमर दमन जीन की लंबाई भी 0.5-2 केबी है।

रेट्रोवायरल वेक्टर प्रणाली में अतिरिक्त सुधार किए गए हैं: परिणामी वायरल कणों की संख्या में वृद्धि की गई है, पारगमन की दक्षता में वृद्धि की गई है, गैर-विभाजित कोशिकाओं में उनके प्रवेश को सुनिश्चित करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग संशोधन किया गया है, और की विशिष्टता संक्रमण बढ़ गया है. बाद के मामले में, पुनः संयोजक रेट्रोवायरल वेक्टर के जीनोम को दूसरे वायरस के खोल में पैक किया जाता है, जिसका प्रोटीन रेट्रोवायरस की बाध्यकारी विशिष्टता और इसके द्वारा संक्रमित कोशिकाओं की सीमा को निर्धारित करता है। इस घटना को फेनोटाइपिक मिश्रण कहा जाता है (छद्म प्रकार का गठन)।एक फेनोटाइपिक रूप से मिश्रित वायरस एक सेल लाइन के सहसंक्रमण द्वारा निर्मित होता है जो जीन उत्पादों को संश्लेषित करता है झूठऔर पोलपुनः संयोजक रेट्रोवायरल वेक्टर और जीन अभिव्यक्ति वेक्टर envएक और वायरस. एक जीन को बदलकर पर्यावरण,आप या तो वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के स्पेक्ट्रम को कड़ाई से परिभाषित प्रकार तक सीमित कर सकते हैं, या इसका विस्तार कर सकते हैं। इसके अलावा, जीन में envरेट्रोवायरस, आप एक पेप्टाइड एन्कोडिंग न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम सम्मिलित कर सकते हैं जो एक विशिष्ट सेलुलर रिसेप्टर से जुड़ता है और वांछित कोशिकाओं में पुनः संयोजक रेट्रोवायरस की शुरूआत सुनिश्चित करता है। अंत में, चिकित्सीय जीन अभिव्यक्ति की विशिष्टता कोशिका-विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में प्राप्त की जा सकती है।

एडेनोवायरल वैक्टर

एडेनोवायरस गैर-विभाजित मानव कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं और व्यापक रूप से जीवित टीकों के रूप में उपयोग किए जाते हैं जो बिना किसी दुष्प्रभाव के श्वसन संक्रमण और गैस्ट्रोएंटेराइटिस को रोकते हैं। ये गुण एडेनोवायरस को लक्ष्य कोशिकाओं तक जीन पहुंचाने के लिए आशाजनक बनाते हैं।

एडेनोवायरल वेक्टर प्राप्त करने के लिए, ई1 एडेनोवायरल जीन उत्पादों को संश्लेषित करने वाली एक सेल लाइन को एडेनोवायरस जीनोम के दो खंडों के साथ सहसंक्रमित किया गया था (चित्र 21.7)। उनमें से एक गैटास्मिड के रूप में मौजूद हो सकता है ई कोलाईऔर इसमें E1 क्षेत्र के बजाय, एक "चिकित्सीय" जीन होता है, जो एडेनोवायरस के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों से घिरा होता है, और दूसरा एक एडेनोवायरस डीएनए अणु होता है जिसमें एल क्षेत्र सहित 5"-टर्मिनल क्षेत्र का अभाव होता है, और इसमें एक अतिव्यापी क्षेत्र होता है चिकित्सीय जीन को ले जाने वाला प्लास्मिड, उनके ओवरलैप के क्षेत्र में दो ट्रांसफ़ेक्टिंग डीएनए टुकड़ों के बीच पुनर्संयोजन से पूर्ण लंबाई वाले एडेनोवायरल जीन की बहाली होती है, जिसमें चिकित्सीय जीन E1 क्षेत्र के बजाय स्थित होता है मेजबान कोशिका द्वारा आपूर्ति किए गए उत्पाद लसीका के परिणामस्वरूप कोशिका से निकलने वाले वायरल कणों का निर्माण शुरू करते हैं। पुनर्संयोजन की अनुपस्थिति में, अपर्याप्त लंबाई वाले ट्रांसफ़ेक्टिंग अणुओं को वायरल कणों में पैक नहीं किया जा सकता है प्रतिकृति-सक्षम वायरस बनाने के लिए मेजबान कोशिका जीनोम में E1 क्षेत्र और एक पुनः संयोजक एडेनोवायरस के डीएनए के बीच बेहद कम है।

एक पुनः संयोजक एडेनोवायरस एक लक्ष्य कोशिका को संक्रमित करने के बाद, इसका डीएनए नाभिक में प्रवेश करता है, जहां "चिकित्सीय" जीन व्यक्त होता है। पुनः संयोजक डीएनए गुणसूत्र में एकीकृत नहीं होता है और थोड़े समय तक बना रहता है, इसलिए, एडेनोवायरल वैक्टर का उपयोग करके जीन थेरेपी करते समय, उन्हें निश्चित अंतराल पर पेश करना आवश्यक होता है।

सिस्टिक फाइब्रोसिस के लिए जीन थेरेपी के लिए नैदानिक ​​​​परीक्षणों में एडेनोवायरल वैक्टर का उपयोग किया गया है।

पौधों को रूपांतरित करते समय, पौधों के विषाणुओं से निर्मित वैक्टरों का भी उपयोग किया जाता है। हालाँकि, उनका चयन सीमित है। ऐसा इसलिए है क्योंकि अधिकांश पौधों के वायरस में आनुवंशिक सामग्री के रूप में आरएनए होता है, जबकि केवल कुछ, जैसे कि फूलगोभी मोज़ेक वायरस (सीएएमवी) और जेमिनी समूह के वायरस में डीएनए उनकी आनुवंशिक सामग्री के रूप में होता है। वायरल वैक्टर का नुकसान सम्मिलित जीन की सीमित लंबाई (200 से 500 बीपी तक) और पौधों की प्रजातियों के संबंध में उच्च विशिष्टता है। इस प्रकार, फूलगोभी मोज़ेक वायरस का उपयोग केवल क्रूस परिवार से संबंधित पौधों को बदलने के लिए किया जा सकता है।

वेक्टर रहित सिस्टम

जीन गन (चित्र 13.1)।इस विधि को कहा जाता है जैविक बैलिस्टिक.इसमें वैक्यूम तोप से फायरिंग होती है (जीन गन)पादप कोशिकाओं, प्रोटोप्लास्ट और कैली का निलंबन। पौधों के लक्ष्यों (ऊतकों) पर बमबारी सोने या टंगस्टन (व्यास 0.6-1.2 माइक्रोन) के कणों से की जाती है, जिस पर विदेशी डीएनए का छिड़काव किया जाता है। पौधों की कोशिकाओं को एक विशेष सिलोफ़न प्लेट पर रखा जाता है। धातु के कण कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं, और उनमें डीएनए छोड़ देते हैं। इस मामले में, लगभग 10-15% कोशिकाएँ रूपांतरित हो जाती हैं, जिनमें से कुछ सामान्य पौधों में पुनर्जीवित हो जाती हैं। यद्यपि परिवर्तन प्रक्रिया यादृच्छिक है, आज तक, इस विधि का उपयोग करके ट्रांसजेनिक पौधे, मुख्य रूप से मोनोकोटाइलडोनस फसलें (मकई, चावल, गेहूं, आदि) प्राप्त किए गए हैं।

चावल। 13.1.

(ज़िल्के, 2001. - पी. 21)

विद्युतीकरण विधि. यह किसी कोशिका में सीधे डीएनए डालने की विधियों में से एक है। पादप कोशिकाएँ विदेशी डीएनए युक्त माध्यम में डूबी होती हैं। इस माध्यम से 250-300 V की विद्युत धारा प्रवाहित की जाती है (एक सेकंड के अंशों में!) परमाणु झिल्ली के बढ़े हुए छिद्रों के माध्यम से, विदेशी डीएनए नाभिक में प्रवेश करता है और गुणसूत्रों में शामिल होता है।

माइक्रोइंजेक्शन विधि.माइक्रोनीडल्स (बाहरी व्यास 2 माइक्रोमीटर) का उपयोग करके, विदेशी डीएनए को कांच से जुड़ी कोशिकाओं के नाभिक में पेश किया जाता है पॉलीलीसीन.

"विलय एजेंटों" का उपयोग.धनावेशित लिपिड गोले ( लिपिड), जो वेक्टर डीएनए को ढंकता है, इसे न्यूक्लिअस की कार्रवाई से बचाता है। लिपोसोम्स में मौजूद डीएनए उनकी मदद से पौधों की कोशिकाओं में प्रवेश करता है (तंत्र को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है) और जीनोम में शामिल किया गया है।