Terapia genowa. Terapia genowa – jak działa, co leczy, zalety i wady Problemy, przed którymi stoi terapia genowa

14943 0

Ustalenie lokalizacji i sekwencji genu, którego mutacje powodują określone choroby, a także samej mutacji i nowoczesnych metod jej badania, pozwalają na rozpoznanie choroby w neo-, a nawet prenatalnym okresie rozwoju organizmu. Umożliwia to złagodzenie objawów wady genetycznej za pomocą leków, diety, transfuzji krwi itp.

Jednak takie podejście nie prowadzi do skorygowania samej wady i z reguły chorób dziedzicznych nie leczy się. Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że mutacja w jednym genie może mieć bardzo różny wpływ na organizm. Jeśli mutacja genu powoduje zmiany w aktywności kodowanego przez niego enzymu, może to prowadzić do akumulacji toksycznego substratu lub odwrotnie, do niedoboru związku niezbędnego do prawidłowego funkcjonowania komórki.

Dobrze znanym przykładem takiej choroby jest fenyloketonuria. Jest to spowodowane mutacją w genie enzymu wątrobowego dehydroksylazy fenyloalaniny, który katalizuje konwersję fenyloalaniny do tyrozyny. W efekcie wzrasta poziom endogennej fenyloalaniny we krwi, co powoduje nieprawidłowe tworzenie się osłonki mielinowej wokół aksonów komórek nerwowych ośrodkowego układu nerwowego i w efekcie poważne upośledzenie umysłowe.

Jeśli mutacja dotyczy genu białka strukturalnego, może prowadzić do poważnych zaburzeń na poziomie komórek, tkanek lub narządów. Przykładem takiej choroby jest mukowiscydoza.

Delecja w genie kodującym białko zwane transporterem mukowiscydozy powoduje wadliwą syntezę białek (brak fenyloalaniny 508) i upośledzony transport jonów chlorkowych przez błony komórkowe. Jednym z najbardziej szkodliwych skutków tego jest to, że śluz wyściełający i chroniący płuca staje się nienormalnie gęsty. Utrudnia to dostęp do komórek płuc i sprzyja gromadzeniu się szkodliwych mikroorganizmów. Komórki wyściełające drogi oddechowe płuc obumierają i są zastępowane włóknistą tkanką bliznowatą (stąd nazwa choroby). W rezultacie pacjent umiera z powodu niewydolności oddechowej.

Choroby dziedziczne mają złożone objawy kliniczne, a ich tradycyjne leczenie ma głównie charakter objawowy: w leczeniu fenyloketonurii przepisuje się dietę bez alaniny, wadliwe białka zastępuje się funkcjonalnym podawaniem dożylnym oraz przeprowadza się przeszczep szpiku kostnego lub innego narządu w celu zrekompensowania utraconych funkcji . Wszystkie te środki są zwykle nieskuteczne, drogie, czasochłonne, a tylko nieliczni pacjenci dożywają starości. Dlatego bardzo ważny jest rozwój całkowicie nowych rodzajów terapii.

Terapia genowa

Terapia genowa to inżynieria genetyczna ludzkich komórek somatycznych mająca na celu skorygowanie defektu genetycznego powodującego chorobę. Korekcję konkretnej choroby przeprowadza się poprzez wprowadzenie genów o normalnej ekspresji do wadliwych komórek somatycznych. W latach 80. XX wieku opracowano metody uzyskiwania poszczególnych genów i stworzono eukariotyczne wektory ekspresyjne, eksperymenty z transferem genów na myszach stały się rutyną, a perspektywy korekcji genów stały się realne.

W 1990 roku w Stanach Zjednoczonych dr W. French Andrson podjął pierwszą próbę zastosowania terapii genowej w leczeniu ciężkiego złożonego niedoboru odporności (SCID) u trzyletniej dziewczynki Ashanti da Silva. Choroba ta spowodowana jest mutacją w genie kodującym adenosanadenylazę (ADA). Niedobór tego enzymu przyczynia się do gromadzenia się adenozyny i dezoksyadenozyny we krwi, czego toksyczne działanie prowadzi do śmierci limfocytów B i T krwi obwodowej, a w konsekwencji do niedoborów odporności.

Dzieci chore na tę chorobę należy chronić przed wszelkimi infekcjami (przechowywać w specjalnych sterylnych komorach), ponieważ każda choroba może być śmiertelna. Cztery lata od rozpoczęcia leczenia u dziecka wykazano prawidłowo funkcjonującą ADA i złagodzenie objawów SCID, co pozwoliło jej opuścić sterylną komorę i żyć normalnie.

Tym samym wykazano zasadniczą możliwość skutecznej terapii genetycznej komórek somatycznych. Od lat 90. Terapia genowa jest testowana pod kątem szeregu chorób genetycznych, w tym tak ciężkich jak hemofilia, AIDS, różne rodzaje nowotworów złośliwych, mukowiscydoza itp. Obecnie za pomocą transgenezy można wyleczyć około 10 chorób człowieka.

Różnorodność chorób genetycznych doprowadziła do opracowania wielu podejść do terapii genowej. W tym przypadku rozwiązano 2 główne problemy: sposób dostarczenia genu terapeutycznego; sposób zapewnienia ukierunkowanego dostarczania do komórek przeznaczonych do korekcji. Do chwili obecnej wszystkie podejścia do terapii genowej komórek somatycznych można podzielić na dwie kategorie: terapię ex vivo i terapię in vivo (ryc. 3.15).

Ryż. 3.15. Schemat terapii genowej ex vivo (a) i in vivo (a)

Terapia genowa ex vivo obejmuje genetyczną korektę wadliwych komórek poza organizmem, a następnie powrót normalnie funkcjonujących komórek z powrotem do organizmu.

Terapia genowa in vivo polega na dostarczaniu genu terapeutycznego bezpośrednio do komórek określonej tkanki pacjenta. Przyjrzyjmy się tym podejśćom bardziej szczegółowo.

Terapia genowa ex vivo obejmuje następujące etapy:
1) pobranie od pacjenta wadliwych komórek i ich hodowanie;
2) przeniesienie pożądanego genu do izolowanych komórek przy użyciu transfekcji konstruktu genu terapeutycznego;
3) selekcja i namnażanie komórek poprawionych genetycznie;
4) przeszczepienie lub transfuzja tych komórek pacjentowi.

Wykorzystanie własnych komórek pacjenta gwarantuje, że po zwróceniu nie rozwinie się u nich odpowiedź immunologiczna. Procedura przenoszenia konstruktu genowego musi być skuteczna, a normalny gen musi być stabilnie utrzymywany i stale wyrażany.

Stworzonym przez samą naturę środkiem przenoszenia genów są wirusy. W celu uzyskania skutecznych wektorów do dostarczania genów wykorzystuje się głównie dwie grupy wirusów – adenowirusy i retrowirusy (ryc. 3.16). W terapii genowej wykorzystuje się warianty wirusów zneutralizowanych genetycznie.

Ryż. 3.16. Wirusy wykorzystywane do tworzenia wektorów terapeutycznych

Rozważmy projektowanie i wykorzystanie projektów opartych na retrowirusach. Przypomnijmy, że genom retrowirusa jest reprezentowany przez dwie identyczne jednoniciowe cząsteczki RNA, z których każda składa się z sześciu sekcji: dwóch długich powtórzeń końcowych (LTR) na końcach 5” i 3”, sekwencja niekodująca * P+, niezbędny do upakowania RNA w cząsteczce wirusa, oraz trzy regiony kodujące białko strukturalne wewnętrznego kapsydu (gag), odwrotną transkryptazę (pol) i białko otoczki (env) (ryc. 3.17a).

Ryż. 3.17. Mapa genetyczna typowego retrowirusa (a) i mapa wektora retrowirusowego (a)

Przypomnijmy, że cykl życiowy retrowirusa obejmuje następujące etapy:
1. Infekcja komórek docelowych.
2. Synteza kopii DNA genomu z wykorzystaniem własnej odwrotnej transkryptazy.
3. Transport wirusowego DNA do jądra.
4. Włączenie wirusowego DNA do chromosomu komórki gospodarza.
5. Transkrypcja mRNA z wirusowego DNA pod kontrolą silnego promotora zlokalizowanego w regionie 5"-LTR.
6. Tłumaczenie białek Gag, Pol i Env.
7. Tworzenie kapsydu wirusa i pakowanie dwóch łańcuchów RNA i cząsteczek odwrotnej transkryptazy.
8. Uwolnienie wirionów z komórki.

Podczas uzyskiwania wektora retrowirusowego do plazmidu wprowadza się pełnej długości DNA retrowirusa, usuwa się większość genu gag oraz całe geny pol i env, a zamiast nich „terapeutyczny” gen T i, jeśli to konieczne, , wstawiany jest selektywny gen markerowy Rg z własnym promotorem (ryc. 3.17, b ). Transkrypcja genu T będzie kontrolowana przez ten sam silny promotor zlokalizowany w regionie 5"-LTR. W oparciu o ten schemat stworzono różne wektory retrowirusowe i maksymalną wielkość wstawki DNA wynoszącą około 8 tys. bp.

Otrzymany w ten sposób konstrukt może sam zostać wykorzystany do transformacji, ale jego wydajność i późniejsza integracja z genomem komórki gospodarza jest wyjątkowo niska. Dlatego opracowano technikę pakowania pełnej długości RNA wektora retrowirusowego w nienaruszone cząstki wirusa, które z dużą częstotliwością przenikają do komórki i gwarantują integrację z genomem gospodarza. W tym celu stworzono tzw. linię komórkową „pakującą”. W dwóch różnych odcinkach chromosomów tych komórek osadzone są retrowirusowe geny gag i pol-env, pozbawione zdolności do pakowania ze względu na brak sekwencji + (84*+) (ryc. 3.18).

Ryż. 3.18. Schemat otrzymywania opakowanego wektora wirusowego

Oznacza to, że oba te fragmenty ulegają transkrypcji, ale powstają puste kapsydy pozbawione RNA. Kiedy wektor wirusowy RNA jest transfekowany do takich komórek, jest on integrowany z chromosomalnym DNA i ulega transkrypcji, tworząc retrowirusowy RNA pełnej długości i w takich warunkach tylko wektor RNA jest pakowany w kapsydach (tylko zawiera sekwencję +). Powstałe nienaruszone cząstki wirusa wykorzystuje się do skutecznego dostarczania wektora retrowirusowego do komórek docelowych.

Retrowirusy aktywnie infekują tylko szybko dzielące się komórki. Aby przenieść geny, poddaje się je działaniu oczyszczonych cząstek opakowanego wektora retrowirusowego lub hoduje się wspólnie z linią komórkową, która je wytwarza, a następnie selekcjonuje w celu oddzielenia komórek docelowych od komórek pakujących.

Transdukowane komórki są dokładnie sprawdzane pod kątem poziomu syntezy produktu genu terapeutycznego, braku retrowirusów kompetentnych do replikacji i braku zmian w zdolności komórek do wzrostu lub funkcjonowania.

Komórki szpiku kostnego są najbardziej odpowiednie do terapii genowej. Dzieje się tak dzięki obecności totipotencjalnych embrionalnych komórek macierzystych, które potrafią proliferować i różnicować się w różne typy komórek – limfocyty B i T, makrofagi, erytrocyty, płytki krwi i osteoklasty. To właśnie te komórki są stosowane w leczeniu wielu chorób dziedzicznych, w tym wspomnianego już ciężkiego złożonego niedoboru odporności, choroby Gauchera, anemii sierpowatokrwinkowej, talasemii, osteoporozy itp.

Oprócz totipotencjalnych komórek macierzystych szpiku kostnego, które są trudne do izolacji i hodowli, w leczeniu hipercholesterolemii wykorzystuje się komórki macierzyste z krwi pępowinowej (preferowane zastosowanie w terapii genowej u noworodków), a także komórki wątroby – hepatocyty.

W terapii genowej in vivo szczególnie ważne jest zapewnienie dostarczenia genu terapeutycznego do uszkodzonych komórek. Takie ukierunkowane dostarczanie można zapewnić za pomocą zmodyfikowanych wektorów stworzonych na bazie wirusów zdolnych do infekowania określonych typów komórek. Rozważmy podejście opracowane do leczenia mukowiscydozy wspomniane już powyżej. Ponieważ płuca są otwartą jamą, stosunkowo łatwo jest dostarczyć do nich geny terapeutyczne. Sklonowaną wersję zdrowego genu wprowadzono do inaktywowanego adenowirusa (ryc. 3.19). Specyfika tego typu wirusa polega na tym, że infekuje on błonę śluzową płuc, powodując przeziębienie.

Ryż. 3.19. Schemat otrzymywania wektora na bazie adenowirusa

Tak skonstruowany wirus testowano przez rozpylanie go do nosa i płuc zwierząt doświadczalnych, a następnie na ludzi. W niektórych przypadkach zaobserwowano wprowadzenie i ekspresję zdrowego genu oraz przywrócenie prawidłowego transportu jonów chlorkowych. Możliwe, że to podejście (wprowadzenie prawidłowego genu za pomocą aerozoli do nosa) będzie w najbliższej przyszłości szeroko stosowane w leczeniu objawów mukowiscydozy w płucach.

Oprócz retro- i adenowirusów w eksperymentach terapii genowej wykorzystuje się także inne typy wirusów, na przykład wirus opryszczki pospolitej. Szczególną cechą tego dwuniciowego wirusa DNA (152 kb) jest jego zdolność do specyficznego infekowania neuronów. Znanych jest wiele chorób genetycznych wpływających na ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy – nowotwory, zaburzenia metaboliczne, choroby neurodegeneracyjne (choroba Alzheimera, choroba Parkinsona).

Wirus opryszczki pospolitej typu I (HSV) jest bardzo odpowiednim wektorem do leczenia takich chorób. Kapsyd tego wirusa łączy się z błoną neuronu, a jego DNA jest transportowane do jądra. Zaproponowano kilka metod przenoszenia genu terapeutycznego przy użyciu wektorów HSV i przeprowadzono udane testy na zwierzętach doświadczalnych.

Wektory wirusowe mają kilka wad: wysoki koszt, ograniczoną zdolność klonowania i możliwą reakcję zapalną. I tak w 1999 roku w wyniku rozwoju niezwykle silnej odpowiedzi immunologicznej na wprowadzenie wektora adenowirusowego zmarła 18-letnia ochotniczka, która brała udział w badaniach leków. W 2002 r. u dwójki dzieci we Francji podczas leczenia niedoborów odporności (poprzez wprowadzenie genów terapeutycznych do komórek macierzystych za pomocą retrowirusów) rozwinęła się choroba przypominająca białaczkę.

Dlatego opracowywane są niewirusowe systemy dostarczania genów. Najprostszym i najbardziej nieskutecznym sposobem jest wstrzyknięcie plazmidowego DNA do tkanek. Drugie podejście polega na bombardowaniu tkanek mikrocząsteczkami złota (1-3 mikronów) sprzężonymi z DNA. W tym przypadku geny terapeutyczne ulegają ekspresji w tkankach docelowych, a ich produkty – białka terapeutyczne – przedostają się do krwi. Główną wadą tego podejścia jest przedwczesna inaktywacja lub zniszczenie tych białek przez składniki krwi.

DNA można dostarczyć pakując je w sztuczną otoczkę lipidową. Otrzymane w ten sposób sferyczne cząstki liposomów z łatwością przenikają przez błonę komórkową. Powstały liposomy o różnorodnych właściwościach, jednak jak dotąd skuteczność takiego dostarczania jest niska, gdyż większość DNA ulega zniszczeniu lizosomalnemu. Ponadto, aby dostarczyć konstrukt genetyczny, koniugaty DNA syntetyzuje się z różnymi cząsteczkami, które mogą zapewnić jego bezpieczeństwo, ukierunkowane dostarczanie i przenikanie do komórki.

W ostatnich latach prowadzone są intensywne eksperymenty mające na celu stworzenie sztucznego chromosomu 47, który umożliwiłby włączenie dużej ilości materiału genetycznego z pełnym zestawem elementów regulatorowych dla jednego lub większej liczby genów terapeutycznych. Umożliwiłoby to wykorzystanie genomowego wariantu genu terapeutycznego, a tym samym zapewniłoby jego stabilność i efektywną długoterminową ekspresję. Eksperymenty wykazały, że stworzenie sztucznego ludzkiego chromosomu zawierającego geny terapeutyczne jest całkiem możliwe, jednak nie jest jeszcze jasne, jak wprowadzić tak ogromną cząsteczkę do jądra komórki docelowej.

Do głównych wyzwań stojących przed terapią genową, poza ryzykiem wystąpienia ciężkiej reakcji immunologicznej, należą trudności w długotrwałym przechowywaniu i funkcjonowaniu terapeutycznego DNA w organizmie pacjenta, wielogenowy charakter wielu chorób, co czyni je trudnymi celami terapii genowej oraz ryzyko wykorzystania wirusów jako wektorów.

NA. Voinov, T.G. Volova

Wstęp

Z roku na rok w czasopismach naukowych pojawia się coraz więcej artykułów na temat medycznych badań klinicznych, w których w taki czy inny sposób stosowano leczenie polegające na wprowadzaniu różnych genów – terapię genową. Kierunek ten wyrósł z tak dobrze rozwijających się dziedzin biologii, jak genetyka molekularna i biotechnologia.

Często, gdy wypróbowano już konwencjonalne (konserwatywne) metody, to właśnie terapia genowa może pomóc pacjentom przeżyć, a nawet w pełni wyzdrowieć. Dotyczy to na przykład dziedzicznych chorób monogenowych, czyli takich, które są spowodowane defektem pojedynczego genu, a także wielu innych. Lub, na przykład, terapia genowa może pomóc i uratować kończynę pacjentów, którzy zwężyli światło naczyń krwionośnych w kończynach dolnych, w wyniku czego rozwinęło się trwałe niedokrwienie otaczających tkanek, to znaczy tkanki te doświadczają poważny brak składników odżywczych i tlenu, które normalnie są przenoszone przez krew po całym organizmie. Często niemożliwe jest leczenie takich pacjentów za pomocą zabiegów chirurgicznych i leków, ale jeśli komórki zostaną lokalnie zmuszone do uwolnienia większej ilości czynników białkowych, które wpływają na proces tworzenia i kiełkowania nowych naczyń, wówczas niedokrwienie stanie się znacznie mniej wyraźne, a życie stanie się dużo łatwiej dla pacjentów.

Terapia genowa obecnie można zdefiniować jako leczenie chorób poprzez wprowadzanie genów do komórek pacjentów w celu specyficznej zmiany defektów genów lub nadania komórkom nowych funkcji. Pierwsze badania kliniczne metod terapii genowej podjęto całkiem niedawno – 22 maja 1989 roku, w celu diagnostyki nowotworów. Pierwszą chorobą dziedziczną, w leczeniu której zastosowano terapię genową, był wrodzony niedobór odporności.

Z każdym rokiem rośnie liczba pomyślnie przeprowadzonych badań klinicznych nad leczeniem różnych chorób za pomocą terapii genowej i w styczniu 2014 roku osiągnęła ona 2 tys.

Jednocześnie we współczesnych badaniach nad terapią genową należy wziąć pod uwagę, że konsekwencje manipulacji genami lub „przetasowania” (rekombinowanego) DNA na żywo(łac. dosłownie „w żywych”) nie zostały wystarczająco zbadane. W krajach o najbardziej zaawansowanym poziomie badań w tym zakresie, zwłaszcza w Stanach Zjednoczonych, protokoły medyczne wykorzystujące sensowne sekwencje DNA podlegają obowiązkowej weryfikacji przez odpowiednie komitety i komisje. W USA są to Komitet Doradczy ds. Rekombinacji DNA (RAC) oraz Agencja ds. Żywności i Leków (FDA), z późniejszym obowiązkowym zatwierdzeniem projektu przez dyrektora Narodowego Instytutu Zdrowia.

Zdecydowaliśmy więc, że leczenie to polega na tym, że jeśli w niektórych tkankach organizmu brakuje pewnych indywidualnych czynników białkowych, to można to skorygować wprowadzając do tych tkanek odpowiednie geny kodujące białka i wszystko stanie się bardziej lub bardziej mniej cudowne. Nie będzie możliwości wprowadzenia samych białek, gdyż nasz organizm od razu zareaguje silną reakcją immunologiczną, a czas działania będzie niewystarczający. Teraz musisz zdecydować o sposobie dostarczenia genu do komórek.

Transfekcja komórki

Na początek warto wprowadzić definicje niektórych terminów.

Transport genów odbywa się dzięki wektor to cząsteczka DNA wykorzystywana jako „nośnik” do sztucznego przenoszenia informacji genetycznej do komórki. Istnieje wiele rodzajów wektorów: plazmidowe, wirusowe, a także kosmidy, straszmidy, sztuczne chromosomy itp. Zasadnicze znaczenie ma to, aby wektory (w szczególności plazmidowe) posiadały charakterystyczne dla siebie właściwości:

1. Pochodzenie replikacji (ori)- sekwencja nukleotydów, od której rozpoczyna się duplikacja DNA. Jeśli wektor DNA nie będzie mógł się podwoić (replikować), to nie zostanie osiągnięty niezbędny efekt terapeutyczny, ponieważ zostanie po prostu szybko rozłożony przez wewnątrzkomórkowe enzymy nukleazy, a z powodu braku matryc ostatecznie powstanie znacznie mniej cząsteczek białka. Należy zaznaczyć, że punkty te są specyficzne dla każdego gatunku biologicznego, czyli jeśli DNA wektora ma zostać uzyskane w drodze namnażania go w hodowli bakteryjnej (a nie tylko poprzez syntezę chemiczną, która jest zwykle znacznie droższa), to dwa wymagane będą oddzielne źródła replikacji - dla ludzi i bakterii;

2. Miejsca z ograniczeniami- specyficzne krótkie sekwencje (zwykle palindromiczne), które są rozpoznawane przez specjalne enzymy (endonukleazy restrykcyjne) i cięte przez nie w określony sposób - z utworzeniem „lepkich końcówek” (ryc. 1).

Ryc.1 Tworzenie „lepkich końcówek” przy udziale enzymów restrykcyjnych

Miejsca te są niezbędne do połączenia DNA wektora (który w istocie jest „pusty”) z pożądanymi genami terapeutycznymi w pojedynczą cząsteczkę. Taka cząsteczka usieciowana z dwóch lub więcej części nazywana jest „rekombinowaną”;

3. Oczywiste jest, że chcielibyśmy uzyskać miliony kopii rekombinowanej cząsteczki DNA. Ponownie, jeśli mamy do czynienia z hodowlą komórek bakteryjnych, to DNA należy wyizolować. Problem w tym, że nie wszystkie bakterie połkną potrzebną nam cząsteczkę; niektóre tego nie zrobią. Aby rozróżnić te dwie grupy, wstawiają markery selektywne- obszary odporności na niektóre chemikalia; Teraz, jeśli dodasz te właśnie substancje do środowiska, przetrwają tylko te, które są na nie odporne, a reszta umrze.

Wszystkie te trzy składniki można zaobserwować w pierwszym sztucznie zsyntetyzowanym plazmidzie (ryc. 2).

Ryc.2

Nazywa się proces wprowadzania wektora plazmidowego do określonych komórek transfekcja. Plazmid to dość krótka i zwykle okrągła cząsteczka DNA, która znajduje się w cytoplazmie komórki bakteryjnej. Plazmidy nie są związane z chromosomem bakteryjnym, mogą replikować się niezależnie od niego, mogą być uwalniane przez bakterię do środowiska lub odwrotnie, wchłaniane (proces absorpcji jest transformacja). Za pomocą plazmidów bakterie mogą wymieniać informacje genetyczne, na przykład przekazując oporność na niektóre antybiotyki.

Plazmidy występują naturalnie w bakteriach. Ale nikt nie może zabronić badaczowi sztucznej syntezy plazmidu, który będzie miał potrzebne mu właściwości, wstawienia do niego wstawki genowej i wprowadzenia go do komórki. Do tego samego plazmidu można wstawić różne wstawki .

Metody terapii genowej

Istnieją dwa główne podejścia, różniące się charakterem komórek docelowych:

1. Płód, w którym obcy DNA zostaje wprowadzony do zygoty (zapłodnionego jaja) lub zarodka we wczesnym stadium rozwoju; w tym przypadku oczekuje się, że wprowadzony materiał przedostanie się do wszystkich komórek biorcy (a nawet komórek rozrodczych, zapewniając w ten sposób transmisję na następne pokolenie). W naszym kraju jest to wręcz zabronione;

2. Somatyczny, w którym materiał genetyczny jest wprowadzany do komórek niereprodukcyjnych już narodzonej osoby i nie jest przekazywany do komórek rozrodczych.

Terapia genowa na żywo polega na bezpośrednim wprowadzeniu sklonowanych (namnożonych) i spakowanych sekwencji DNA w określony sposób do określonych tkanek pacjenta. Szczególnie obiecujące w leczeniu chorób genowych in vivo jest wprowadzanie genów za pomocą szczepionek w aerozolu lub wstrzykiwanych. Terapia genowa w aerozolu jest z reguły opracowywana w celu leczenia chorób płuc (mukowiscydoza, rak płuc).

Opracowanie programu terapii genowej składa się z wielu etapów. Obejmuje to dokładną analizę tkankowo-specyficznej ekspresji odpowiedniego genu (tj. syntezę na matrycy genu jakiegoś białka w określonej tkance) i identyfikację pierwotnego defektu biochemicznego oraz badanie struktury, funkcji i wewnątrzkomórkową dystrybucję produktu białkowego, a także analizę biochemiczną procesu patologicznego. Wszystkie te dane są brane pod uwagę przy sporządzaniu odpowiedniego protokołu lekarskiego.

Ważne jest, aby podczas opracowywania schematów korekcji genów ocenić skuteczność transfekcji i stopień korekcji pierwotnego defektu biochemicznego w warunkach hodowli komórkowej ( in vitro,„in vitro”) i, co najważniejsze, na żywo na zwierzęcych modelach biologicznych. Dopiero po tym będzie można rozpocząć program badań klinicznych .

Bezpośrednie dostarczanie i komórkowe nośniki genów terapeutycznych

Istnieje wiele metod wprowadzania obcego DNA do komórki eukariotycznej: niektóre opierają się na obróbce fizycznej (elektroporacja, magnetofekcja itp.), inne na wykorzystaniu materiałów chemicznych lub cząstek biologicznych (np. wirusów), które służą jako nośniki. Warto od razu wspomnieć, że metody chemiczne i fizyczne zazwyczaj łączy się (np. elektroporacja + owijanie DNA w liposomach)

Metody bezpośrednie

1. Transfekcję chemiczną można podzielić na kilka typów: z wykorzystaniem substancji cyklodekstrynowej, polimerów, liposomów lub nanocząstek (z lub bez funkcjonalizacji chemicznej lub wirusowej, tj. modyfikacji powierzchni).
a) Jedną z najtańszych metod jest użycie fosforanu wapnia. Zwiększa efektywność inkorporacji DNA do komórek 10-100 razy. DNA tworzy silny kompleks z wapniem, co zapewnia jego efektywne wchłanianie. Wada - tylko około 1 - 10% DNA dociera do jądra. Zastosowana metoda in vitro do przenoszenia DNA do komórek ludzkich (ryc. 3);

Ryc.3

b) Zastosowanie silnie rozgałęzionych cząsteczek organicznych – dendrymerów, do wiązania DNA i przeniesienia go do komórki (ryc. 4);

Ryc.4

c) Bardzo skuteczną metodą transfekcji DNA jest jego wprowadzenie poprzez liposomy – małe, otoczone błoną ciałka, które mogą łączyć się z błoną cytoplazmatyczną komórki (CPM), która jest podwójną warstwą lipidów. W przypadku komórek eukariotycznych transfekcja jest skuteczniejsza przy użyciu liposomów kationowych, ponieważ komórki są na nie bardziej wrażliwe. Proces ma swoją nazwę - lipofekcja. Metoda ta jest obecnie uważana za jedną z najbezpieczniejszych. Liposomy są nietoksyczne i nieimmunogenne. Skuteczność transferu genów za pomocą liposomów jest jednak ograniczona, ponieważ DNA wprowadzane przez nie do komórek jest zwykle natychmiastowo wychwytywane przez lizosomy i niszczone. Wprowadzenie DNA do komórek ludzkich za pomocą liposomów jest dziś podstawą terapii. na żywo(ryc. 5);

Ryc.5

d) Inną metodą jest zastosowanie polimerów kationowych, takich jak dietyloaminoetylodekstran lub polietylenoimina. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA wiążą się z dodatnio naładowanymi polikationami, a kompleks ten dalej wnika do komórki na drodze endocytozy. DEAE-dekstran zmienia właściwości fizyczne błony komórkowej i stymuluje wchłanianie tego kompleksu do wnętrza komórki. Główną wadą tej metody jest to, że DEAE-dekstran jest toksyczny w wysokich stężeniach. Metoda ta nie stała się powszechna w terapii genowej;

e) Za pomocą histonów i innych białek jądrowych. Białka te, zawierające wiele dodatnio naładowanych aminokwasów (Lys, Arg), w warunkach naturalnych pomagają kompaktowo upakować długi łańcuch DNA w stosunkowo małym jądrze komórkowym.

2. Metody fizyczne:

a) Bardzo popularną metodą jest elektroporacja; Natychmiastowy wzrost przepuszczalności błony osiąga się poprzez poddanie komórek krótkiej ekspozycji na intensywne pole elektryczne. Wykazano, że w optymalnych warunkach liczba transformantów może osiągnąć 80% komórek, które przeżyły. Nie jest obecnie stosowany u ludzi (ryc. 6).

Ryc.6

b) „Wyciskanie komórek” to metoda wynaleziona w 2013 roku. Pozwala ona na dostarczenie cząsteczek do komórek poprzez „delikatne ściskanie” błony komórkowej. Metoda eliminuje możliwość wystąpienia toksyczności lub błędnego ukierunkowania, ponieważ nie opiera się na materiałach zewnętrznych ani polach elektrycznych;

c) Sonoporacja to metoda sztucznego przenoszenia obcego DNA do komórek poprzez wystawienie ich na działanie ultradźwięków, powodując otwarcie porów w błonie komórkowej;
d) Transfekcja optyczna – metoda polegająca na wykonaniu w membranie maleńkiego otworu (o średnicy około 1 μm) za pomocą silnie skupionego lasera;
e) Transfekcja hydrodynamiczna – metoda dostarczania konstruktów genetycznych, białek itp. poprzez kontrolowany wzrost ciśnienia w naczyniach włosowatych i płynie międzykomórkowym, co powoduje krótkotrwały wzrost przepuszczalności błon komórkowych i powstawanie w nich przejściowych porów. Przeprowadza się ją poprzez szybkie wstrzyknięcie do tkanki, a podanie jest nieswoiste. Wydajność dostarczania do mięśni szkieletowych - od 22 do 60% ;

f) Mikroiniekcja DNA - wprowadzenie do jądra komórki zwierzęcej przy użyciu cienkich szklanych mikrotubul (d=0,1-0,5 µm). Wadą jest złożoność metody, istnieje duże prawdopodobieństwo zniszczenia jądra lub DNA; transformowana może być ograniczona liczba komórek. Nie do użytku przez ludzi.

3. Metody cząstkowe.

a) Bezpośrednim podejściem do transfekcji jest pistolet genowy, w którym DNA łączy się w nanocząstkę z obojętnymi ciałami stałymi (najczęściej złotem, wolframem), która następnie jest „wstrzeliwana” i kierowana do jąder komórek docelowych. Ta metoda jest stosowana in vitro I na żywo do wprowadzania genów, w szczególności do komórek tkanki mięśniowej, na przykład w chorobie takiej jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a. Wielkość cząstek złota wynosi 1-3 mikrony (ryc. 7).

Ryc.7

b) Magnetofekcja to metoda wykorzystująca siły magnetyzmu w celu dostarczenia DNA do komórek docelowych. Najpierw kwasy nukleinowe (NA) kojarzone są z nanocząsteczkami magnetycznymi, a następnie pod wpływem pola magnetycznego cząstki te są wprowadzane do wnętrza komórki. Skuteczność wynosi prawie 100%, odnotowano oczywistą nietoksyczność. W ciągu 10-15 minut cząsteczki zostają zarejestrowane w komórce – jest to znacznie szybciej niż innymi metodami.
c) Przebicie, „przebicie”, dosł. „przebicie” + „infekcja”) – metoda dostarczania wykorzystująca nanomateriały, takie jak nanorurki i nanowłókna węglowe. W tym przypadku komórki są dosłownie przebijane warstwą nanowłókien. Przedrostkiem „nano” określa się ich bardzo małe rozmiary (w zakresie miliardowych części metra) (ryc. 8).

Ryc.8

Osobno warto wyróżnić taką metodę, jak transfekcja RNA: do komórki dostarczany jest nie DNA, ale cząsteczki RNA - ich „następcy” w łańcuchu biosyntezy białek; w tym przypadku aktywowane są specjalne białka, które tną RNA na krótkie fragmenty – tzw. mały interferujący RNA (siRNA). Fragmenty te wiążą się z innymi białkami, co ostatecznie prowadzi do zahamowania ekspresji odpowiednich genów w komórce. W ten sposób można zablokować w komórce działanie tych genów, które w danej chwili potencjalnie wyrządzają więcej szkody niż pożytku. Transfekcja RNA znalazła szerokie zastosowanie, zwłaszcza w onkologii.

Omówiono podstawowe zasady dostarczania genów za pomocą wektorów plazmidowych. Teraz możemy przejść do rozważań nad metodami wirusowymi. Wirusy to niekomórkowe formy życia, składające się najczęściej z cząsteczki kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) owiniętej w białkową otoczkę. Jeśli wytniemy z materiału genetycznego wirusa wszystkie sekwencje wywołujące choroby, wówczas cały wirus również będzie można z powodzeniem zamienić w „nośnik” dla naszego genu.

Nazywa się proces wprowadzania DNA do komórki za pośrednictwem wirusa transdukcja.
W praktyce najczęściej stosowane są retrowirusy, adenowirusy i wirusy powiązane z adenowirusami (AAV). Na początek warto dowiedzieć się, jaki powinien być idealny kandydat do transdukcji pomiędzy wirusami. Kryteria są takie, że musi to być:

Stabilny;
. pojemny, to znaczy mieszczący wystarczającą ilość DNA;
. obojętny w stosunku do szlaków metabolicznych komórki;
. precyzyjny – w idealnym przypadku powinien integrować swój genom z określonym locus genomu jądra gospodarza itp.

W życiu bardzo trudno jest połączyć przynajmniej kilka punktów, dlatego zazwyczaj wyboru dokonuje się rozpatrując każdy przypadek z osobna (ryc. 9).

Ryc.9

Spośród wszystkich trzech wymienionych najczęściej używanych wirusów, najbezpieczniejsze i jednocześnie najdokładniejsze są AAV. Niemal jedyną ich wadą jest stosunkowo mała pojemność (około 4800 pz), która jednak okazuje się wystarczająca dla wielu genów .

Oprócz wymienionych metod terapię genową często stosuje się w połączeniu z terapią komórkową: najpierw hodowlę niektórych ludzkich komórek sadzi się w pożywce, po czym w taki czy inny sposób wprowadza się do komórek niezbędne geny, hoduje się przez jakiś czas i ponownie przeszczepiane do ciała żywiciela. W rezultacie komórki mogą powrócić do swoich normalnych właściwości. I tak na przykład ludzkie białe krwinki (leukocyty) zmodyfikowano pod kątem białaczki (ryc. 10).

Ryc.10

Los genu po wejściu do komórki

Ponieważ w przypadku wektorów wirusowych wszystko jest mniej więcej jasne ze względu na ich zdolność do skuteczniejszego dostarczania genów do ostatecznego celu - jądra, zastanowimy się nad losem wektora plazmidowego.

Na tym etapie udało nam się osiągnąć, że DNA przekroczyło pierwszą dużą barierę – błonę cytoplazmatyczną komórki.

Następnie w połączeniu z innymi substancjami, otoczonymi lub nie, musi dotrzeć do jądra komórkowego, aby specjalny enzym – polimeraza RNA – zsyntetyzował cząsteczkę informacyjnego RNA (mRNA) na matrixie DNA (proces ten nazywa się transkrypcja). Dopiero po tym mRNA zostanie uwolniony do cytoplazmy, tworzy kompleks z rybosomami i zgodnie z kodem genetycznym syntetyzowany zostaje polipeptyd - na przykład czynnik wzrostu naczyń (VEGF), który zacznie pełnić określoną funkcję terapeutyczną ( w tym przypadku rozpocznie proces tworzenia się rozgałęzień naczyń w tkance narażonej na niedokrwienie).

Jeśli chodzi o ekspresję wprowadzonych genów w wymaganym typie komórki, problem ten rozwiązuje się za pomocą elementów regulujących transkrypcję. Tkankę, w której zachodzi ekspresja, często określa się poprzez połączenie specyficznego tkankowo wzmacniacza („sekwencja wzmacniająca”) ze specyficznym promotorem (sekwencja nukleotydów, od którego rozpoczyna się synteza polimerazy RNA), który może być indukowany . Wiadomo, że aktywność genów można modulować na żywo sygnały zewnętrzne, a ponieważ wzmacniacze mogą współpracować z dowolnym genem, do wektorów można wprowadzić izolatory, które pomagają wzmacniaczowi działać niezależnie od jego położenia i mogą działać jako bariery funkcjonalne między genami. Każdy wzmacniacz zawiera zestaw miejsc wiązania dla aktywujących lub hamujących czynników białkowych. Promotory można również stosować do regulowania poziomu ekspresji genów. Na przykład, istnieją promotory metalotioneiny lub wrażliwe na temperaturę; promotory kontrolowane przez hormony.

Ekspresja genu zależy od jego pozycji w genomie. W większości przypadków istniejące metody wirusowe skutkują jedynie przypadkowym wprowadzeniem genu do genomu. Aby wyeliminować taką zależność, przy konstruowaniu wektorów do genu dostarczane są znane sekwencje nukleotydowe, które pozwalają na ekspresję genu niezależnie od miejsca jego wstawienia do genomu.

Najprostszym sposobem regulacji ekspresji transgenu jest dostarczenie mu promotora wskaźnikowego, który jest wrażliwy na sygnał fizjologiczny, taki jak uwolnienie glukozy lub niedotlenienie. Takie „endogenne” systemy kontroli mogą być przydatne w niektórych sytuacjach, takich jak zależna od glukozy kontrola produkcji insuliny. „Egzogenne” systemy kontroli są bardziej niezawodne i uniwersalne, gdy ekspresja genów jest kontrolowana farmakologicznie poprzez wprowadzenie małej cząsteczki leku. Obecnie znane są 4 główne systemy kontroli - regulowane przez tetracyklinę (Tet), steroid owadzi, ekdyson lub jego analogi, lek przeciwprogestynowy mayfpriston (RU486) oraz chemiczne dimeryzatory, takie jak rapamycyna i jej analogi. Wszystkie obejmują zależne od leku przyciąganie domeny aktywacji transkrypcji do głównego promotora prowadzącego pożądany gen, różnią się jednak mechanizmami tego przyciągania .

Wniosek

Przegląd danych pozwala nam dojść do wniosku, że pomimo wysiłków wielu laboratoriów na całym świecie, wszystko już znane i przetestowane na żywo I in vitro systemy wektorowe są dalekie od doskonałości . Jeżeli jest problem z dostarczeniem obcego DNA in vitro praktycznie rozwiązany i jego dostarczanie do komórek docelowych różnych tkanek na żywo pomyślnie rozwiązane (głównie poprzez stworzenie konstruktów przenoszących białka receptorowe, zawierające antygeny specyficzne dla określonych tkanek), wówczas inne cechy istniejących układów wektorowych – stabilność integracji, regulowana ekspresja, bezpieczeństwo – nadal wymagają poważnych udoskonaleń.

Przede wszystkim dotyczy to stabilności integracji. Do tej pory integrację z genomem osiągano jedynie przy użyciu wektorów retrowirusowych lub związanych z adenowirusami. Skuteczność stabilnej integracji można zwiększyć poprzez ulepszenie konstruktów genowych, takich jak systemy, w których pośredniczy receptor, lub poprzez utworzenie wystarczająco stabilnych wektorów episomalnych (tj. struktur DNA zdolnych do długotrwałego przebywania w jądrach). Ostatnio szczególną uwagę poświęcono tworzeniu wektorów opartych na sztucznych chromosomach ssaków. Dzięki obecności podstawowych elementów strukturalnych zwykłych chromosomów, takie minichromosomy utrzymują się w komórkach przez długi czas i są w stanie przenosić pełnowymiarowe (genomowe) geny i ich naturalne elementy regulatorowe, niezbędne do prawidłowego funkcjonowania genu, we właściwej tkance i we właściwym czasie.

Terapia genowa i komórkowa otwiera wspaniałe perspektywy odbudowy utraconych komórek i tkanek oraz projektowania inżynierii genetycznej narządów, co niewątpliwie znacząco poszerzy arsenał metod badań biomedycznych i stworzy nowe możliwości zachowania i przedłużenia życia ludzkiego.

30 sierpnia 2017 r. amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła pierwszą na świecie terapię genową raka krwi. Jest to lek Kymriah (tisagenlecleucel) firmy Novartis Pharmaceuticals, oparty na technologii CAR-T i przeznaczony do leczenia ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek B u dzieci i młodych dorosłych pacjentów w wieku poniżej 25 lat, którzy są oporni na inne metody leczenia lub mają nawrót choroby.

Zastosowanie technologii edycji genomu CRISPR/Cas9 otwiera nowe możliwości w terapii genowej. CRISPR/Cas9 pozwala na bardzo precyzyjną i bezpieczną zmianę DNA komórek. A jeśli połączyć technologię CRISPR/Cas9 z dostarczaniem za pomocą wirusów związanych z adenowirusami, to najwyraźniej pozwoli to na systemowe oddziaływanie na organizm i całkowicie bezpieczną zmianę genomu bardzo dużej liczby komórek.

Z kolei w 2016 roku genetycy z Duke University (USA) ogłosili, że po raz pierwszy w historii udało im się skutecznie przeprowadzić terapię genową na dorosłym ssaku (myszach) i wyleczyć go z choroby genetycznej związanej z dystrofią mięśni. W tym celu wykorzystano zmodyfikowaną wersję stosunkowo nowej technologii edycji genów CRISPR/Cas9. Technologia edycji genów CRISPR/Cas9 polega na wykorzystaniu wirusa związanego z adenowirusem w celu dostarczenia materiału genetycznego do miejsca przeznaczenia. Dzięki tej technologii przeprowadzono udane eksperymenty dotyczące edycji genów poszczególnych komórek w probówkach i zarodkach jednokomórkowych. Niestety, możliwość manipulacji genetycznych ludzkimi embrionami nadal budzi kontrowersje.

CRISPR/Cas przekroczył wszelkie oczekiwania. Umożliwiło to przy minimalnej liczbie błędów zarówno „wyłączenie” niezbędnych genów, jak i wstawienie nowych genów w ściśle określone rejony genomu.

W grudniu 2015 roku grupa naukowa Feng Janga zmodyfikowała ten system tak, aby stał się całkowicie wolny od błędów, co zostało opublikowane w wiodącym czasopiśmie naukowym Science. Naukowcy zastąpili w endonukleazie Cas9 3 aminokwasy, z których zbudowane jest białko, dzięki czemu liczba błędów w takim układzie została zredukowana niemal do zera.

Zastosowanie CRISP/Cas9 jest szczególnie istotne w terapii genowej starzenia, gdzie konieczne jest wpływanie na ścieżki długowieczności wspólne dla większości komórek organizmu. Do 2015 r. nie przeprowadzono ani jednego badania klinicznego na ludziach dotyczącego terapii genowej starzenia się, co nie jest zaskakujące, ponieważ starzenie się wciąż nie jest uznawane za chorobę.

Ponadto terapia genowa starzenia się jest wciąż bardzo młodą i rozwijającą się dziedziną. Obecnie wszystkie badania nad terapią genową starzenia prowadzone są na modelowych myszach, szczurach, małpach oraz na hodowlach komórek ludzkich – komórkach in vitro.

Wszystkie podejścia do terapii genowej starzenia dzielą się na te, w których gen długowieczności jest dostarczany do organizmu, oraz te, w których wprowadzane są małe RNA, które „wyłączają” gen lub szlak starzenia. Oznacza to, że w pierwszym przypadku wprowadza się coś przydatnego dla długowieczności, a w drugim wyłącza się coś szkodliwego. W ścisłym tego słowa znaczeniu przed 2015 rokiem przeprowadzono jedynie dwa badania dotyczące terapii genowej starzenia się ssaków.

Znacznie więcej prac dotyczy modeli terapii genowej u myszy transgenicznych. W takich badaniach gen terapeutyczny nie jest dostarczany do organizmu dorosłej myszy, lecz za pomocą inżynierii genetycznej powstają myszy, których genom uległ zmianie od urodzenia. Podobnie jak terapia genowa, pozwala zbadać, jak zwiększenie lub zmniejszenie aktywności różnych genów wpływa na długość życia i starzenie się organizmu.

Przyjrzyjmy się, co teoretycznie mogłaby zrobić terapia genowa i inżynieria genetyczna w walce ze starzeniem się.

Przewaga terapii genowej nad innymi metodami przedłużania życia

Po co nam terapia genowa, skoro możemy stosować leki przeciwstarzeniowe (geroprotektory)? W porównaniu z innymi podejściami do przedłużania życia (na przykład geroprotektorami lub ograniczenie żywności, przedłużając życie nawet o 30-50%), wystarczy przeprowadzić terapię genową tylko raz w życiu, a tabletki trzeba brać cały czas i nie zapominać – w przeciwnym razie efekt nie będzie pełny. Na przykład w pracy Andrzeja Bartke z 2001 roku Ograniczenie diety przedłużyło życie myszy o 30%. Jednak myszy spożywały dietę niskokaloryczną aż do 670 dni z rzędu – czyli codziennie przez połowę ich życia! Dla większości ludzi nie jest to realistyczne. Natomiast w eksperymencie Marii Blasco z terapią genową (omówionym w dalszej części artykułu) z 2012 roku terapia genowa telomerazy przyniosła nieco mniejszy efekt – myszy zaczęły żyć o 20% dłużej. Jednak w tej pracy myszy otrzymały tylko 1 zastrzyk leku do krwi przez całe życie w dość zaawansowanym wieku!

Jeśli zatem mówimy o przełożeniu badań nad przedłużeniem życia na człowieka, to terapia genowa ma absolutną zaletę, gdyż nie powoduje obniżenia jakości życia ze względu na konieczność ciągłego leczenia – stosowania na co dzień określonej diety lub stale stosuj geroprotektory lub inne leki. Terapia genowa jest również wysoce ukierunkowana i dlatego może powodować mniej skutków ubocznych.

Ponadto leki mają ograniczoną biodostępność w różnych tkankach i narządach.

Wprowadzenie genu telomerazy (TERT) dwuletnim myszom typu dzikiego (40-50 lat w przeliczeniu na lata ludzkie) pojedynczym wstrzyknięciem zwiększa długość telomerów i wydłuża ich życie o 20%.

Naukowiec zasugerował, że w komórkach istnieje pewien licznik podziałów, który ogranicza ich całkowitą liczbę. 10 lat później rosyjski naukowiec Aleksiej Ołownikow zaproponował hipotetyczny mechanizm działania tego licznika.

Ołownikow zasugerował, że podczas podziału komórek końce chromosomów, zwane telomerami, nieznacznie się skracają. A kiedy telomery osiągną krytyczną długość, komórka przestaje się dzielić i starzeje. Następnie Elizabeth Helen Blackburn, amerykańska cytogenetyka, została laureatką Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny za rok 2009 wraz z Carol Greider i Jackiem Shostakiem ze sformułowaniem „za odkrycie mechanizmów ochrony chromosomów przez telomery i enzym telomerazy” według teoria zaproponowana w 1971 roku przez Aleksieja Ołownikowa.

W komórkach nie starzejących się (na przykład zarodkowych i embrionalnych komórkach macierzystych) przeciwnie, musi występować enzym, który wydłuża telomery, umożliwiając komórkom podział niemal w nieskończoność. Ponadto wykazano, że uszkodzenie genu telomerazy znacznie skraca życie zwierząt modelowych i prowadzi do rozwoju zespołu przedwczesnego starzenia się – progerii.

Po odkryciu telomerazy kilkudziesięciu naukowców zainteresowało się opracowaniem na jej bazie leku na starość. Wydawać by się mogło, że „włączenie” telomerazy we wszystkich komórkach może uczynić organizm nieśmiertelnym. Wkrótce jednak pojawiły się obawy, ponieważ w 90% nowotworów nowotworowych obserwuje się aktywną syntezę telomerazy. Pojawiło się pytanie: czy aktywacja telomerazy będzie wiązać się z ryzykiem transformacji nowotworowej?

Ponadto okazało się, że starzeniu się komórek nie zawsze towarzyszy skracanie telomerów. Na przykład w przypadku komórek nabłonkowych błony śluzowej jamy ustnej lub rogówki ludzkiego oka. Sugerowało to, że sama aktywacja telomerazy może nie wystarczyć do odmłodzenia całego organizmu. Przed przejściem do terapii genowej badano działanie telomerazy na myszach transgenicznych. Okazało się, że jeśli „włączysz” gen TERT we wszystkich komórkach myszy, oczekiwana długość życia wzrośnie o 40%! Jednak utrzymująca się aktywność telomerazy zwiększała również ryzyko raka. W związku z tym pojawiło się pytanie, jak aktywować telomerazę na krótszy okres czasu.

Dokładnie to samo uczyniła artykuł Marii Blasco z 2012 roku (patrz wykres). Gen telomerazy dostarczono do ciała myszy przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV9), który jest zdolny do dostarczania ogólnoustrojowego. Wirusy towarzyszące adeno charakteryzują się wysokim bezpieczeństwem: nie integrują dostarczonego genu z genomem gospodarza, a co za tym idzie, nie prowadzą do mutagenezy (brak ryzyka nowotworu). Ponadto prawie nie wywołują odpowiedzi immunologicznej. Jednocześnie terapia genem TERT okazała się całkowicie bezpieczna: ryzyko zachorowania na raka u myszy nie wzrosło. Dwuletnim myszom podano jeden zastrzyk adenowirusa, do którego wprowadzono gen telomerazy. Wydłużyło to życie myszy o 20% (jak pokazano na powyższym wykresie). A to teoretycznie mogłoby pozwolić osobom w wieku 40-50 lat na wykonanie jednego zastrzyku takiego leku i przedłużenie życia o kolejne 8-12 lat.

Obecnie telomerazę można stymulować za pomocą leków. Ciekawe badanie w tym zakresie przeprowadzili naukowcy z Uniwersytetu w Lublanie (Słowenia) w 2016 roku, po szeregu udanych badań klinicznych dotyczących odmładzania naczyń za pomocą niskich dawek walsartanu i fluwastatyny. Tym razem zmierzyli aktywność telomerazy po odmłodzeniu naczyń w próbkach krwi od 130 pacjentów.

Zatem miesięczny kurs znacząco zwiększa aktywność telomerazy o 3,28 razy, co istotnie koreluje z poprawą funkcji śródbłonka (odmładzanie naczyń) i zmniejszeniem stanu zapalnego w naczyniach krwionośnych. I ten podwyższony poziom telomerazy utrzymuje się, stopniowo spadając, przez kolejne sześć miesięcy. Nie wiadomo jednak, jak skutecznie ten wzrost poziomu telomerazy wpływa na telomery.

Warto wiedzieć, że telomery niekoniecznie przedłużą nam życie, jeśli taka terapia nie będzie prowadzona w odpowiednim czasie i zbyt długo.

Ponadto sama stymulacja telomerazy może nie wydłużać telomerów. Aktywność telomerazy pozostaje prawie niezmieniona wraz z wiekiem – spójrz na wykres po lewej stronie. Ale telomery nadal są skrócone.

Również dzisiaj na rynku dostępny jest lek zwiększający aktywność telomerazy - TA-65. Jest bardzo drogi i w badaniach nie wykazano, aby w jakikolwiek sposób przedłużał życie myszy. Spójrz na wykres po lewej stronie. W badaniu z 2011 roku naukowcy z Hiszpańskiego Narodowego Centrum Onkologii podawali długowiecznym dwuletnim myszom TA-65 w celu zwiększenia telomerazy, podobnie jak w poprzednim badaniu. Tylko w poprzednim badaniu myszom wstrzyknięto terapię genową. Jednak lek TA-65 w żaden sposób nie przedłużył życia myszy, w przeciwieństwie do terapii genowej (patrz wykres po lewej stronie) i okazał się całkowicie bezużyteczny w przedłużaniu życia i spowalnianiu starzenia.

W 2011 roku naukowcy z Uniwersytetu w Teksasie badali telomery i telomerazę w hodowlach komórkowych ponad 60 gatunków ssaków. Rola telomerów w długowieczności nie była aż tak oczywista... Badania pokazują (porównując około 60 gatunków ssaków), że im dłuższe telomery gatunku, tym szybciej kumulują się mutacje w DNA, tym więcej guzów nowotworowych i krótsza średnia długość życia . Długość telomerów jest odwrotnie skorelowana z długością życia. Sugeruje to, że działanie telomerazy wydłużające życie, które uzyskano u myszy po pojedynczym wstrzyknięciu, może nie wydłużać życia ludzi. Kwestia telomerów pozostaje dla ludzi otwarta.

Wniosek: W przyszłości teoretycznie będziemy mogli zwiększyć długość telomerów poprzez wprowadzenie genu telomerazy (TERT) w wieku 40-50 lat za pomocą jednego zastrzyku, jednak sama taka terapia zdecydowanie nie wystarczy. Najszybciej trzeba znaleźć kombinację efektów terapii genowej, która znacząco wydłuży życie człowieka. Dziś możemy imitować efekt stosując jednomiesięczną terapię raz na pół roku kombinacją leków walsartan 20 mg + fluwastatyna 10-20 mg, Lub telmisartan + atorwastatyna 10 mg. Przynajmniej te leki w połączeniu są w stanie stymulować samą telomerazę.

Zakłócenie genu Agtr1a, który koduje receptory angiotensyny AT1a, wydłuża życie myszy transgenicznych o 26% w porównaniu z myszami typu dzikiego.

Antagoniści receptora angiotensyny II, czyli blokery receptora AT1, stanowią jedną z nowych grup leków przeciwnadciśnieniowych (leków stosowanych w leczeniu ciśnienia krwi). Leki te obejmują wszystkie leki grupy sartanowe (na przykład telmisartan).

Na przykładzie naczelnych Kaplan pokazał, że jeśli zbierze się grupę samców naczelnych, to w ciągu kilku dni małpy wypracują hierarchię społeczną. Najgorsze miejsce w takiej hierarchii jest na samym dole. Samce naczelnych na podległych stanowiskach wykazują szereg wskaźników przewlekłego stresu. Często rozwija się u nich miażdżyca. Kiedy naukowcy podali samcom naczelnych znajdującym się na dole hierarchii społecznej (zagrożonym) beta-blokerem propranolol, tłumiąc aktywność współczulnego układu nerwowego, wówczas nie rozwinęła się miażdżyca naczyń.

Okazało się, że współczulny układ nerwowy pod wpływem stresu negatywnie wpływa na rozwój miażdżycy oraz bierze udział w problemach z sercem i naczyniami krwionośnymi. Stres emocjonalny realizuje się poprzez współczulny (adrenergiczny) autonomiczny układ nerwowy, który łączy ośrodki kontrolne naszego mózgu i narządów wewnętrznych. Włącznie z chorobami układu odpornościowego, szpiku kostnego itp. Miażdżyca jest głównym czynnikiem powodującym największą liczbę zgonów w krajach rozwiniętych z powodu zawału serca i udaru mózgu.

Randomizowane, podwójnie ślepe i kontrolowane placebo badanie przeprowadzone w 1983 roku przez Goldsteina S i wsp. wykazało, że terapia propranolol u 3837 pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego zmniejsza śmiertelność z powodu chorób układu krążenia (przyczyna nr 1 zgonów na świecie).

W marcu 2017 r. francuscy naukowcy poinformowali o udanych badaniach klinicznych terapii genowej w leczeniu anemii sierpowatokrwinkowej.

Komitet Amerykańskiej Narodowej Akademii Nauk i Narodowej Akademii Medycznej udzielił wsparcia dla edycji genomu ludzkich embrionów już w 2017 roku. Ale tylko w przypadku poważnych chorób i pod ścisłą kontrolą.

wnioski

1. Wszystkie podejścia do terapii genowej starzenia dzielą się na te, w których gen długowieczności jest dostarczany do organizmu i takie, w których gen lub szlak starzenia się zostaje „wyłączony”.

2. W porównaniu z innymi podejściami do przedłużania życia, terapię genową należy przeprowadzić tylko raz w życiu.

3. Wprowadzenie genu telomerazy (TERT), dysrupcja genu Agtr1a, nokaut GHRKO, destrukcja genów kodujących receptory IGF-1, nadekspresja FGF21, nokaut AC5, delecja RIP3, edycja genu PCSK9, nadekspresja Klotho, nokaut RAGE, nadekspresja BubR1, nadekspresja MTH1 – to przykłady najskuteczniejszych metod inżynierii genetycznej czy terapii genowej wydłużającej życie zwierząt.

4. Aby osiągnąć bardziej znaczące wyniki w terapii genowej przeciwdziałającej starzeniu się i inżynierii genetycznej przeciwdziałającej starzeniu, konieczne jest połączenie różnych podejść. Dodaj tagi

Pierwsza część (przed niebieską linią) to wprowadzenie do terapii genowej, w zasadzie po to, żeby lepiej zrozumieć same metody i choć trochę, żeby nie dać się złapać nauczycielowi. Jeśli nie masz czasu i potrzebujesz KONKRETNEGO materiału na pytanie, przewiń w prawo obok niebieskiej linii.

Terapia genowa początkowo miała na celu leczenie jednogenowych chorób dziedzicznych, jednak z czasem jej zakres rozszerzył się i zaczęto ją postrzegać jako potencjalnie uniwersalne podejście do leczenia całego spektrum chorób, w tym chorób zakaźnych, nowotworów, miażdżycy, cukrzycy i szeregu innych. .

„Leczenie genowe”- korekta defektu genu (choroby monogenowe) - na poziomie komórek somatycznych i rozrodczych - zastąpienie zmutowanego genu normalnym.

„Leczenie genami”- korekta wady poprzez wprowadzenie pełnoprawnego działającego genu (cDNA).

Na początek trochę ogólnej teorii:

Istotnym warunkiem powodzenia terapii genowej jest zapewnienie skutecznej dostawy, czyli tzw. transfekcja (w szerokim znaczeniu) lub transdukcja (przy zastosowaniu wektorów wirusowych) obcego genu do komórek docelowych, zapewniając jego długotrwałe funkcjonowanie w tych komórkach i tworząc warunki do pełnego funkcjonowania genu (jego ekspresji).

Strategie korygowania wad genetycznych:

Według rodzaju systemu wektorowego:

Wirusowy

Zalety wektorów wirusowych: transdukcja dużej liczby komórek; tropizm; odporność na degradację lizosomalną.

Wady wektorów wirusowych: immunogenność (ze skutkiem śmiertelnym – adeno- i herpeswirusy); potencjalna rakotwórczość (retrowirusy).

Niewirusowy

· Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórki, tkanki, narządu (znane również jako mikroiniekcja);

Lipofekcja (za pomocą różnych modyfikowanych liposomów (pęcherzyków lipidowych zawierających DNA);

· Elektroporacja;

· Zawiera plazmid;

· Kompleksowy DNA (plazmidowy DNA połączony z solami, białkami itp.);

· Pistolet genowy (DNA jest przyczepione do cząstek złota wystrzelonych w tkankę pacjenta);

· Endocytozy za pośrednictwem receptora.

Korzyści z dostarczania niewirusowego: względne bezpieczeństwo; brak odpowiedzi immunologicznej; łatwość użycia.

Wady dostarczania niewirusowego: niska wydajność transfekcji; niski poziom ekspresji.

Teoretycznie najbardziej radykalnym i skutecznym sposobem jest zastąpienie wadliwego genu w komórkach rozrodczych (płodowa terapia genowa), jednak istnieją problemy etyczne. Obecnie wszystkie podejścia do terapii genowej opierają się na terapii genowej na poziomie komórek somatycznych.

Ze względu na mechanizm działania wstawianego genu lub przeniesionej cząsteczki DNA terapię genową dzieli się na pozytywną (przywrócenie funkcji genu (poprzez przywrócenie jego działania lub wstawienie nowej kopii roboczej) i negatywną – supresja funkcji genu). Ponadto istnieje podejście mające na celu wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej, które jest stosowane głównie w terapii genowej nowotworów (więcej na ten temat poniżej).

Do organizmu człowieka można wprowadzić także nową informację genową, jako część jego komórek uprzednio transformowanych in vitro. podejście ex vivo. Podejście, w którym informacja genowa jest wprowadzana bezpośrednio do komórek żywej osoby, nazywa się (nagle) in vivo, a wprowadzanie lokalne na określone obszary nazywa się in situ. Obecnie w Wielkiej Brytanii istnieją udane precedensy dotyczące wprowadzania informacji genowej w macicy (do zarodka), co ostatnio pozwoliło uratować dziecko przed chorobą mitochondrialną.

Dodatkowe podejścia do terapii genowej:

· Antysensowny DNA, RNA (+): specyficzność, można zastosować w dowolnym wektorze, nieimmunogenny; (-): szybka degradacja w komórce);

· Rybozymy (+): mają właściwości enzymów – nie są zużywane, są zdolne do katalizowania rozszczepienia celu, w przeciwieństwie do białek, są nieimmunogenne, indukują syntezę interferonu; (-): szybka degradacja;

· Transdominujące białka negatywne;

· Przeciwciała jednołańcuchowe;

· Geny samobójcze (zamiast „leczyć” komórkę można ją po prostu zabić i wykorzystać w systemach przeciwnowotworowych (więcej szczegółów poniżej);

· Wprowadzenie limfocytów specyficznych dla antygenu;

· Chimeroplastyka (hybrydy DNA/RNA o strukturze spinki do włosów, powodują rekombinację homologiczną w jądrze);

Oto tylko przykłady metod terapii genowej, opisy chorób znajdują się w poprzednich numerowanych biletach.

Choroby monogenowe:

Niedobór deaminazy adenozyny(zespół ADA) jest pierwszym stosunkowo udanym przykładem zastosowania terapii genowej. Odbyło się ono 14 września 1990 r. Datę tę uważa się za urodziny prawdziwej terapii genowej.

Za pomocą leukoforezy wyizolowano z krwi obwodowej komórki jednojądrzaste, które następnie hodowano w hodowli w warunkach proliferacji limfocytów T. Następnie do komórek proliferujących in vitro wprowadzono wektor retrowirusowy zawierający prawidłowy gen ADA. Kilka dni później transdukowane komórki krwi wstrzyknięto z powrotem pacjentowi. Procedurę powtórzono 7 razy w ciągu 10 miesięcy. Efekt był pozytywny, ¼ limfocytów w organizmie otrzymała działający gen. Wprowadzanie zmodyfikowanych komórek powtarzano co 3-5 miesięcy. Obecnie rozwija się terapia genowa tej choroby w kierunku wykorzystania komórek macierzystych pacjenta. Spowoduje to znaczne zmniejszenie liczby iniekcji zmodyfikowanych komórek ze względu na ich wielokrotne podziały już w samym organizmie, a po osiągnięciu selektywnej i ilościowej przewagi modyfikowanych komórek macierzystych nad natywnymi, wytworzy wystarczający poziom enzymu w organizmie.

Dziedziczna hipercholesterolemia - Wiadomo, że niedzielące się hepatocyty nie mogą zostać zakażone retrowirusami. Po hepatektomii hepatocyty zaczynają się rozmnażać i nabywają zdolność do zakażania retrowirusami. cDNA genu prawidłowego receptora LDL-R wprowadzono do hepatocytów uzyskanych z wątroby pacjenta za pomocą wektora retrowirusowego. Po reinfuzji rekombinowanych hepatocytów przez żyłę wrotną do wątroby zaobserwowano zmniejszenie stężenia lipoprotein o małej gęstości (w szczególności cholesterolu) we krwi oraz zmniejszenie stosunku lipoprotein o małej gęstości do lipoprotein o dużej gęstości. Oznacza to, że wprowadzone komórki funkcjonowały in vivo oraz internalizowały i metabolizowały cholesterol.

Hemofilia B – Przeprowadzono udane eksperymenty na psach, stosując strategię ex vivo
dostarczanie cDNA kodującego czynnik IX do hepatocytów. Udało się osiągnąć syntezę czynnika IX w ilościach stanowiących 0,1% normalnej ilości czynnika IX w osoczu krwi. Próbując zwiększyć stężenie czynnika IX, zastosowano wektory adenowirusowe, ale efekt był krótkotrwały. Krew zwierząt skrzepła, ale efekt całkowicie zniknął po 2 miesiącach (typowa wada wektorów adenowirusowych).

Hemofilia A - Istnieją doniesienia o pomyślnym wprowadzeniu do myszy skróconego genu czynnika VIII jako części wektora retrowirusowego. Dzięki temu osiągany jest terapeutyczny poziom czynnika we krwi.

Mukowiscydoza - Wykazano, że zastąpienie 6-10% komórek nabłonka płuc komórkami transfekowanymi przywróci prawidłowe funkcje transportowe kanałów przezbłonowych zapewniających transport jonów chlorkowych. Retrowirusy nie są odpowiednie, ponieważ nie infekują niedzielących się komórek, adenowirusy są odpowiednie z zastrzeżeniami, ponieważ w doświadczeniach na myszach powodowały reakcje zapalne. Problem leży ponadto w barierze glikokaliksowej na powierzchni komórki. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest modyfikacja wektora zawierającego specyficzny ligand receptora na powierzchni komórek nabłonka płuc. Oddziaływanie ligandu z receptorem zwykle skutkuje internalizacją wektora wraz z receptorem do komórki. Jako taki receptor wybrano transbłonowy receptor P2Y2-R. Receptor ten bierze udział w wywoływaniu kaskady reakcji zapalnych w jamie płuc. Jako ligand zastosowano albo przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko temu receptorowi, albo naturalny ligand, biotynę UTP.

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a - Choroba zaczyna objawiać się już w dzieciństwie i w tym czasie należy przeprowadzić terapię genową. Najbardziej obiecujące jest zastosowanie wektorów adenowirusowych. Ponieważ gen jest długi, badacze używają skróconych, ale funkcjonalnych kopii białka. Eksperymenty na mysich modelach z wadliwym genem dystrofiny wykazały, że od 5 do 50% komórek mięśniowych wykazuje ekspresję skróconego białka dystrofiny. To wystarczyło, aby zminimalizować zwyrodnienie mięśni. Istnieją dane dotyczące badań klinicznych konstruktu genetycznego zawierającego gen dystrofiny w leczeniu pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne'a. Chore dzieci po wstrzyknięciu do mięśni tej konstrukcji nabyły zdolność poruszania się. Jednak efekt był krótkotrwały.

Choroby wieloczynnikowe na przykładzie nowotworu:

Rak jest zwykle konsekwencją wieloetapowych zmian w komórce. Złożoność związana z udziałem wielu genów i ich produktów w procesie nowotworowym wzbudziła wątpliwości co do skuteczności terapii genowej w leczeniu nowotworów. Jednakże istnieje wiele eksperymentów pokazujących, że kompensacja pojedynczego genu supresorowego może prowadzić do supresji właściwości nowotworowych komórek.

Immunoterapia nowotworów:

Zastosowanie konstruktów terapii genowej stymulujących immunologiczną (głównie komórkową) odpowiedź przeciwnowotworową. Do tworzenia konstruktów genowych wykorzystuje się następujące geny: Antygeny (na które reaguje układ odpornościowy); kompleks MHCI (główny kompleks zgodności tkankowej); czynnik B7; Cytokiny; Receptory komórek T. Zahamowanie rozwoju nowotworu można osiągnąć poprzez klonowanie genów cytokin: interleukin IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, a także czynnika martwicy nowotworu-α (TNF-α), interferonów ( INF-α, INF-ϒ)

Hamowanie wzrostu komórek nowotworowych poprzez wprowadzenie do nich genów, których produkty hamują rozwój nowotworu:

Geny supresorowe nowotworu (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, Cyklina D)

· Geny samobójcze

Inhibitory onkogenów

· Czynniki antyangiogenezy

Inhibitory cyklin

· Geny zwiększające wrażliwość komórek nowotworowych na związki lecznicze

· Geny transporterów leków (wprowadzenie np. do komórek szpiku kostnego)

Gen p53 ma ogromne znaczenie w hamowaniu onkogenów (odpowiedzialnych za apoptozę i jest w stanie zatrzymać cykl komórkowy, zapobiegając niekontrolowanemu podziałowi), dlatego jego mutacja prawie zawsze prowadzi do złośliwego zwyrodnienia komórki. Wektory adenowirusowe służą do wprowadzenia do organizmu działającej kopii genu p53. Gdy gen p53 zaczyna ulegać ekspresji w jądrze komórki nowotworowej, indukuje jej apoptozę.

Inne podejście to supresja onkogenów. Mutacja w genie RAS może prowadzić do konstytutywnego działania układu sygnalizacyjnego wyzwalającego podział (kaskada kinaz MAP, pamięta Nikolaychik J.). Aby zablokować ten gen, można: 1) zahamować ekspresję RAS poprzez wprowadzenie nienaruszonego genu; 2) hamowanie RAS przez rybozymy; 3) hamowanie genów położonych dalej na szlaku sygnalizacyjnym; 4) zapobieganie integracji białka RAS z błoną.

Zastosowanie wirusów onkolitycznych. Onkoliza wirusowa to całkowicie nowe podejście do leczenia raka, oparte na naturalnej zdolności wirusów do zabijania (lizy) komórek, w których się namnażają. W tym celu wykorzystuje się reowirusy, poliowirusy, echowirusy i wirusy Coxsackie + niektóre zmodyfikowane adenowirusy, które preferencyjnie namnażają się w komórkach nowotworowych i prowadzą je do apoptozy. Obecnie trwają badania kliniczne preparatu REOLYSIN, produkowanego przez firmę Oncolytic Biotech. Uważa się, że adenowirusy wykazujące ekspresję białek antyangiogennych są bardzo obiecujące.

Zdrowie

Koncepcja zastąpienia wadliwych genów zdrowymi, który zaczął aktywnie zdobywać skorupę naukową już na początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku wydawało się, że da nadzieję najbardziej beznadziejnym pacjentom. Jednak od czasu pierwszego eksperymentu z terapią genową przeprowadzonego w 1990 roku optymizm wśród naukowców nieco osłabł – a wszystko z powodu pewnych niepowodzeń i trudności we wdrażaniu metod terapii genowej. Jednakże możliwości, jakie oferuje terapia genowa w leczeniu choroby Parkinsona, mukowiscydozy, różnych typów nowotworów i wielu innych chorób, są naprawdę nieograniczone. Dlatego naukowcy pracują niestrudzenie, próbując pokonać wszystkie pojawiające się po drodze trudności związane z terapią genową.

Czym jest terapia genowa?

Czym właściwie jest terapia genowa? Aby odpowiedzieć na to pytanie, trzeba o tym przypomnieć Główną funkcją genów w naszym organizmie jest regulacja produkcji białek, niezbędne do prawidłowego funkcjonowania i zdrowia wszystkich komórek. Jednak niektóre defekty genetyczne (wady w genach) zakłócają ich główną funkcję, w takim czy innym stopniu uniemożliwiając produkcję białek. Celem terapii genowej (terapii genowej) jest zastąpienie wadliwych genów zdrowymi. Pomoże to w ustaleniu reprodukcji odpowiedniego białka, co oznacza, że ​​​​dana osoba zostanie wyleczona z określonej choroby.

Jeśli weźmiemy pod uwagę idealny scenariusz rozwoju, komórki z skorygowane cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA). zacznie się dzielić, wytwarzając z kolei wiele kopii skorygowanego genu, co pozwoli organizmowi pozbyć się nieprawidłowości genetycznej i całkowicie wyleczyć. Jednak wprowadzenie zdrowych genów do chorych komórek (a także próba skorygowania odpowiadających im nieprawidłowości) jest procesem niezwykle złożonym, co jak dotąd rzadko kończyło się sukcesem. Dlatego większość współczesnych badań ma na celu opracowanie bezpiecznych i niezawodnych mechanizmów wprowadzania genów do uszkodzonych komórek.

Rodzaje terapii genowych: terapia ex vivo i in vivo

Można zastosować terapię genową, w zależności od sposobu wprowadzenia DNA do genomu pacjenta albo w hodowli komórkowej (ex vivo) albo bezpośrednio w organizmie (in vivo). W przypadku terapii genowej ex vivo komórki są usuwane z organizmu pacjenta, modyfikowane genetycznie, a następnie ponownie wprowadzane do organizmu pacjenta. Metoda ta jest szczególnie przydatna w leczeniu chorób krwi, ponieważ komórki krwi można dość łatwo usunąć i ponownie włożyć. Jednak w przypadku większości innych chorób usunięcie komórek z organizmu i wprowadzenie ich z powrotem nie jest takie proste. Np, w przypadku chorób serca o podłożu genetycznym skutecznym środkiem jest tzw. terapia genowa in vivo, kiedy zmiany genowe przeprowadzane są bezpośrednio w organizmie pacjenta. W celu przeprowadzenia tego zabiegu informacja genetyczna dostarczana jest bezpośrednio do komórki poprzez wektor – cząsteczkę kwasu nukleinowego, wykorzystywane w inżynierii genetycznej do przenoszenia materiału genetycznego. W większości przypadków do przeprowadzenia tej transmisji badacze wykorzystują wirusy, które nie są groźne dla zdrowia i życia.

Metody dostarczania informacji genetycznej do komórki

Jak pokazują liczne badania, stosowanie różnych wirusów jest bardzo skutecznym rozwiązaniem, co pozwala przedostać się przez mechanizmy obronne organizmu, a następnie infekują komórki, wykorzystując je do rozprzestrzeniania wirusa. Do przeprowadzenia tej procedury inżynierowie genetyczni wybrali najodpowiedniejsze wirusy z grupy retrowirusów i adenowirusów. Retrowirusy wprowadzają informację genetyczną w postaci kwasu rybonukleinowego (RNA), cząsteczki podobnej do DNA, która pomaga przetwarzać informację genetyczną przechowywaną w DNA. Gdy tylko uda się wniknąć głęboko w tak zwaną komórkę docelową, z cząsteczki RNA uzyskuje się kopię cząsteczki DNA. Proces ten nazywany jest odwrotną transkrypcją. Kiedy nowa cząsteczka DNA zostanie przyłączona do komórki, wszystkie nowe kopie komórek będą zawierać zmodyfikowany gen.

Adenowirusy przenoszą informację genetyczną bezpośrednio w postaci DNA, które jest dostarczane do niedzielącej się komórki. Chociaż wirusy te dostarczają DNA bezpośrednio do jądra komórki docelowej, DNA nie pasuje do genomu komórki. Zatem zmodyfikowany gen i informacja genetyczna nie są przekazywane komórkom potomnym. Zaletą terapii genowej prowadzonej przy użyciu adenowirusów jest możliwość wprowadzenia genów do komórek układu nerwowego i błony śluzowej dróg oddechowych ponownie za pomocą wektora. Ponadto istnieje trzecia metoda terapii genowej, prowadzona za pomocą tzw. wirusów towarzyszących adenowirusom. Wirusy te zawierają stosunkowo niewielka ilość informacji genetycznej i są znacznie trudniejsze do wyeliminowania niż retrowirusy i adenowirusy. Jednakże zaletą wirusów związanych z adenowirusami jest to, że nie powodują reakcji układu odpornościowego człowieka.

Trudności w stosowaniu wirusów w terapii genowej

Głównym problemem związanym ze sposobem dostarczania informacji genetycznej do komórki za pośrednictwem wirusów jest to, że niezwykle trudno jest całkowicie kontrolować połączenie genów z komórką docelową. Może to być niezwykle niebezpieczne, ponieważ nie można wykluczyć tzw. ekspresji genów, która może przekształcić zdrowe komórki w komórki nowotworowe. W tym momencie problem ten jest szczególnie palący podczas pracy z retrowirusami. Drugi problem rozwiązania, którego nie da się jeszcze zorganizować, jest to, że jedna procedura zastosowania terapii genowej najczęściej nie wystarczy. Większość terapii genetycznych należy od czasu do czasu powtarzać. Po trzecie, wykorzystanie wirusów do dostarczania informacji genetycznej do komórki jest skomplikowane ze względu na ryzyko reakcji układu odpornościowego organizmu. Jest to również niezwykle poważny problem, zwłaszcza w przypadkach, gdy gdy wymagane jest wielokrotne powtórzenie procedury terapii genowej, w miarę jak organizm pacjenta stopniowo się przystosowuje i zaczyna coraz skuteczniej walczyć z wstrzykniętymi wirusami.

Terapia genowa: badania trwają

Jeśli mówimy o sukcesach, to w tym momencie terapia genetyczna jest środkiem niezwykle skutecznym w leczeniu tzw. złożonego niedoboru odporności, powiązany z genem chromosomu X. Z drugiej strony, istnieje bardzo niewiele przypadków skutecznego zastosowania terapii genowej w leczeniu tej choroby. Ponadto samo leczenie jest ryzykowne, ponieważ może spowodować u pacjentów wystąpienie szeregu objawów typowych dla osób chorych na białaczkę. Poza tą chorobą istnieje bardzo, bardzo niewiele przypadków terapii genowej, która byłaby równie skuteczna, choć najnowsze badania dają nadzieję na wczesne zastosowanie terapii genowej do leczenia pacjentów cierpiących na zapalenie stawów, raka mózgu, niedokrwistość sierpowatokrwinkową, rozszczep siatkówki i niektóre inne schorzenia.

Okazuje się, że jest jeszcze bardzo wcześnie, aby mówić o praktycznym zastosowaniu terapii genowej w medycynie. Niemniej jednak, Naukowcy w dalszym ciągu poszukują sposobów bezpiecznego i skutecznego stosowania terapii genowej, po przeprowadzeniu większości eksperymentów na żywej tkance przeniesionej z organizmu do sztucznego środowiska zewnętrznego. Wśród tych eksperymentów niezwykle interesujące są badania, w których naukowcy próbują wprowadzić do komórki docelowej sztuczny, 47. chromosom. Niedawne badania naukowe pozwoliły naukowcom lepiej zrozumieć te procesy zachodzące podczas wprowadzania cząsteczki RNA. Umożliwiło to opracowanie mechanizmu tłumienia transkrypcji genów (zwanego wyłączaniem genu), co może być korzystne w leczeniu choroby Hamiltona. Naukowcy donoszą również, że udało im się opracować sposób dostarczania informacji genetycznej do komórek mózgowych, czego wcześniej nie można było zrobić za pomocą wektora. ponieważ cząsteczka ta była zbyt duża do tego celu. Innymi słowy badania trwają, co oznacza, że ​​ludzkość ma wszelkie szanse nauczyć się walczyć z chorobami poprzez zastosowanie metod terapii genowej.