Hodowle komórkowe

Zwierząt

Wskazanie wirusów na podstawie następujących zjawisk

Opóźnienie rozwoju

śmierć, zmiana

błony zarodkowe, RGA

CPP, tworzenie się płytki nazębnej, RIF, RGads, interferencja

Choroba, śmierć,

zmiany histologiczne

w tkankach, inkluzje

Miareczkowanie wyizolowanego wirusa; wybór dawki roboczej.

Miano wirusa- maksymalne rozcieńczenie materiału zawierającego wirusa, przy którym nadal obserwuje się oczekiwany efekt (CPE, RGA, śmierć zwierzęcia).

Identyfikacja wyizolowanego wirusa w reakcjach neutralizacji, RTGads, RSC, supresji tworzenia się płytki nazębnej itp. za pomocą surowic diagnostycznych. Typ (typ) wirusa określa się poprzez neutralizację specyficznego działania wirusa przez odpowiednią surowicę immunologiczną.

Uwaga: Miareczkowanie i identyfikacja wirusa przeprowadzane są przy użyciu tego samego zjawiska.

Hodowla wirusa

Głównymi metodami stosowanymi w diagnostyce chorób wirusowych jest hodowla i identyfikacja wirusów.

Aby udowodnić wirusową etiologię choroby, konieczne jest: izolacja wirusa z organizmu chorej ryby, przeniesienie go na hodowlę komórkową lub wrażliwą rybę, rozmnażanie choroby u zdrowych ryb tego samego lub pokrewnego gatunku, wielokrotną izolację tego samego wirusa od zwierząt doświadczalnych.

Do identyfikacji wirusów stosuje się kilka uzupełniających się metod: mikroskopię elektronową wirusa, badanie jego właściwości fizykochemicznych, wykrywanie charakterystycznych zmian morfologicznych w zakażonych komórkach i objawów u zakażonych zwierząt, różne metody immunologiczne.

Wirusy izoluje się głównie na jednowarstwowych pierwotnych lub ciągłych hodowlach komórkowych, wybierając każdorazowo hodowle wrażliwe na danego wirusa. Aby uzyskać pierwotne kultury komórek rybich, najczęściej wykorzystuje się gonady samic karpia lub karasia. Gonady powinny znajdować się w II lub II-III stopniu dojrzałości według skali Kiselevicha. Takie gonady nie zawierają jaj widocznych gołym okiem. W przeciwnym razie zawartość jaj będzie miała negatywny wpływ na wzrost komórek. Hodowle komórkowe gonad karpia i karasia przygotowywane są według zatwierdzonej metody.

Jako hodowle ciągłe najczęściej stosuje się następujące linie komórkowe: FHM – z tkanek szypułki ogonowej strzebli grubogłowej; RTG – z gonad pstrąga tęczowego; EPC - z narośli ospy na skórze karpia. Linie te utrzymywane są w wyspecjalizowanych laboratoriach do badania chorób ryb w instytutach badawczych weterynarii i rybołówstwa, gdzie można je zamówić i odebrać.

Podczas diagnozowania dobrze zbadanych chorób wirusowych bada się narządy i tkanki, w których koncentruje się patogen.

W przypadku chorób ryb, o których nie ma wystarczających informacji, badaniom wirusologicznym poddawane są najbardziej dotknięte narządy. Skrawki skóry i skrzeli, fragmenty tych narządów wraz ze śluzem umieszcza się w sterylnych fiolkach zawierających 2-3 ml sterylnego roztworu fizjologicznego lub buforowego. Próbki narządów wewnętrznych pobierane są w ściśle aseptycznych warunkach.

W przypadku braku możliwości szybkiego zbadania materiału, przechowuje się go nie dłużej niż jedną dobę w lodówce w temperaturze nie przekraczającej 5°C. Zamrożony materiał można przechowywać przez dłuższy czas.

Materiał patologiczny przeznaczony do badań jest rozdrabniany w homogenizatorze lub mielony w moździerzu porcelanowym z piaskiem kwarcowym. Z rozdrobnionych tkanek w Hanks, Earle, roztworach buforowych lub soli fizjologicznej przygotowuje się 10% zawiesinę i odwirowuje się przez 10-15 minut przy 2000-3000 obr/min, supernatant odsysa się pipetą i umieszcza w sterylnych fiolkach. Jeżeli zawiesina nie jest sterylna, przygotowane materiały filtruje się przez filtry membranowe o średnicy porów 0,2-0,45 µm lub poddaje działaniu antybiotyków (penicylina 1000 U/ml i streptomycyna 1000 µg/ml).

Z treści jelitowej w sterylnej wodzie destylowanej przygotowuje się 20% zawiesinę i wiruje przez 10-15 minut przy 2000 obr./min. Supernatant ponownie odwirowuje się przy 4000-5000 obr/min przez 30 minut. Następnie supernatant aspiruje się do sterylnej fiolki i traktuje antybiotykami. Dodać 1000 µg/ml streptomycyny i 1000 j./ml penicyliny na 1 ml. Mieszaninę utrzymuje się przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej. Wszystkie materiały są testowane pod kątem sterylności bakteryjnej poprzez zaszczepienie MPB i MPA. Przygotowane materiały od razu wykorzystuje się do pracy lub w skrajnych przypadkach przechowuje w stanie zamrożonym (w temperaturze minus 20°C).

Zakażenie hodowli komórkowej. W przypadku infekcji stosuje się probówki z dobrą monowarstwą komórek lub strefą wzrostu wokół eksplantatu. Pożywkę odsysa się i do każdej probówki dodaje się 0,2-0,3 ml zawiesiny testowej. Jednocześnie do probówek dodaje się 0,8-0,9 ml pożywki zawierającej 2-3% surowicy.

Materiał przygotowany z każdej próbki służy do zakażenia hodowli tkankowych w 4-6 probówkach. Z każdej serii badań pozostawia się taką samą liczbę probówek jako kontrolę, dodając do nich 1 ml pożywki. Probówki pozostawia się w temperaturze pokojowej na 1-2 godziny, aby wirus zaadsorbował się na komórkach, następnie supernatant odsysa się pipetą i dodaje pożywkę podtrzymującą do pierwotnej objętości.

Zakażone i kontrolne hodowle komórkowe inkubuje się w temperaturze 22–26°C i codziennie bada pod mikroskopem o małym powiększeniu w celu wykrycia zmian morfologicznych w komórkach. W przypadku znacznej degeneracji komórek ciecz hodowlaną odsysa się i wykonuje pasaże, a w przypadku braku efektu cytopatogennego (CPE) przeprowadza się dwa kolejne pasaże. W tym celu stosuje się płyn hodowlany wraz z frakcją komórkową zniszczoną w wyniku wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Do zakażenia świeżych kultur należy użyć supernatantu z odwirowanej masy komórkowej. CPE po trzecim pasażu uwzględnia się jako specyficzne działanie czynnika wirusowego.

Stopień uszkodzenia monowarstwy komórek ocenia się za pomocą systemu 4-krzyżowego; „ + – uszkodzenia do 25%, „ + + ” – do 50%, „+ + +” – do 75% oraz „ + + + +” – do 100% monowarstwy.

W niektórych chorobach wirusowych ryb ciała inkluzyjne pojawiają się w komórkach (jądrze cytoplazmatycznym) różnych narządów i tkanek. Materiałem do badania wtrętów wirusowych są zakażone hodowle tkankowe, zeskrobiny i wymazy wyciskowe z narządów i tkanek, które przed barwieniem należy utrwalić ogólnie przyjętymi metodami, stosując płyny Dubosc-Brazil-Buena, Buena, Carnoy lub 10% roztwór neutralny formaldehyd.

Wtręty wirusowe barwi się różnymi metodami: Muromtsev, Rubina, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa itp.

Miareczkowanie wirusa- ilościowe oznaczanie aktywności wirusa. Miano wirusa wyraża się liczbą jednostek zakaźnych zawartych w jednostce objętości zawiesiny wirusa. Zakaźną jednostkę wirusa definiuje się jako dawkę, która powoduje zakażenie u 50% zakażonych wrażliwych obiektów. Ta dawka wirusa nazywana jest zakaźną i oznaczona jako ID 50.

Hodowle komórkowe wykorzystuje się głównie jako wrażliwe obiekty podczas miareczkowania wirusów rybich. Miareczkowanie hodowli komórkowej przeprowadza się zgodnie z cytopatogennym działaniem wirusów. W tym przypadku ID 50 nazywa się dawką cytopatogenną tkankową (TCD 50), a miano wirusa wyraża się ilością TCD 50 w 1 ml zawiesiny wirusa. Miano wirusa określa się metodą końcowego rozcieńczenia. Według tej metody wrażliwe hodowle komórkowe wstrzykują pewną objętość zawiesiny wirusa w sukcesywnie rosnących rozcieńczeniach i biorąc pod uwagę wynik każdego wstrzyknięcia jako dodatni (w przypadku obecności CPP) lub ujemny w przypadku braku CPP, miareczkowanie obliczany jest punkt końcowy - 1 TCD 50.

Do miareczkowania wirusów dających wyraźny CPE stosuje się również metodę łysinkową. W tym przypadku monowarstwę komórek zakażonych wirusem zalewa się mieszaniną pożywki z agarem, aby zapobiec przeniesieniu się wirusa do innych komórek znacznie oddalonych od komórek początkowo zakażonych i aby móc zainfekować początkową ogniska infekcji płytki nazębnej).

Każda łysinka powstaje z pojedynczej jednostki zakaźnej, która jest określana jako PFU (jednostka tworząca łysinkę), a miano wirusa wyraża się jako liczbę PFU na jednostkę objętości zawiesiny.

Reakcja neutralizacji(RN) na hodowli komórkowej.

Reakcja opiera się na wiązaniu antygenu przez przeciwciała homologicznej surowicy odpornościowej. Reakcja służy do identyfikacji patogenów w diagnostyce chorób o etiologii wirusowej. Pozwala na oznaczenie nieznanego antygenu wirusowego na podstawie znanych przeciwciał lub znanego (standardowego) antygenu – nieznanych przeciwciał w surowicy chorych lub wyzdrowiałych ryb.

Oznaczenie wyizolowanego wirusa w reakcji neutralizacji przeprowadza się za pomocą zestawu diagnostycznych hiperimmunologicznych surowic odpornościowych (przeciwciał) z antygenami (wirusami) homologicznymi do nich.

Surowice odpornościowe hiperimmunologiczne uzyskuje się poprzez zakażanie zwierząt laboratoryjnych (na przykład królików) znanymi szczepami wirusów powodujących choroby ryb. Oznacza się miana swoistych przeciwciał w otrzymanych surowicach odpornościowych. Do pracy należy przyjmować antysurowice zawierające przeciwciała w wysokich mianach.

Kolejność reakcji.

1. Inaktywacja surowicy normalnej i hiperimmunizowanej poprzez ogrzewanie w temperaturze 56 o C przez 30 minut.

2. Przygotowanie rozcieńczeń składników reakcji. Antygen i surowicę rozcieńcza się pożywką bez surowicy i antybiotyków, zaczynając od 1:5, 1:50, 1:500 i aż do uzyskania rozcieńczenia zawierającego mniej niż 1 TCD 50 / 0,2 ml. Surowicę hiperimmunizowaną rozcieńcza się w stosunku 1:2 lub 1:5.W przypadku niskiego miana stosuje się surowicę nierozcieńczoną. Surowicę normalną rozcieńcza się w taki sam sposób, jak surowicę hiperimmunizowaną.

3. Przygotowanie reakcji. Trzy rzędy sterylnych probówek umieszcza się na stojaku. Do pierwszego rzędu wlewa się rozcieńczoną surowicę hiperimmunizowaną, do drugiego rozcieńczoną surowicę normalną, a do trzeciego pożywkę. Każdy składnik dodaje się w objętości 0,5 ml.

Przygotowane rozcieńczenia wirusa przenosi się w ilościach 0,5 ml do odpowiednich probówek każdego z trzech rzędów, a wirus każdego rozcieńczenia I przenosi się oddzielną pipetą, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia. W ten sposób w każdym rzędzie probówek uzyskuje się kolejne 10-krotne rozcieńczenia wirusa: 10-1, 10-2 itd.

Aby kontrolować toksyczność surowic, do osobnej probówki należy dodać 0,5 ml przygotowanego rozcieńczenia surowicy hiperimmunizowanej, a następnie dodać taką samą ilość pożywki. To samo należy zrobić ze zwykłym serum.

Probówki z mieszaninami dokładnie wstrząsa się i utrzymuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie hodowlę komórkową infekuje się każdym rozcieńczeniem wirusa (0,2 ml na probówkę) hiperimmunizowaną normalną surowicą i pożywką, po 4 probówki do hodowli komórkowej. Jednocześnie przeprowadza się kontrole toksyczności stosowanych komórek i kontroluje próbki hodowli komórkowych.

Probówki z hodowlą komórkową inkubuje się w termostacie w temperaturze optymalnej dla namnażania danego wirusa i codziennie bada pod mikroskopem o małym powiększeniu w celu wykrycia CPE wirusa. Wyniki wpisuje się do tabeli (Tabela 11).

Miano wirusa wyraża się liczbą jednostek zakaźnych zawartych w jednostce objętości zawiesiny wirusa. Znajdź wskaźnik neutralizacji (IN). Odpowiada maksymalnej ilości ID 50, która może zostać zneutralizowana przez surowicę hiperimmunizowaną. IN oblicza się ze wzoru: logIN = logT 1 - lgT 2, gdzie T 1 oznacza miano wirusa w obecności prawidłowej surowicy; T 2 - miano wirusa w obecności surowicy hiperimmunizowanej. Wartość IN można znaleźć w tabeli antylogarytmów. Ogólnie przyjmuje się, że wartość IN do 10 jest ujemna, od 10 do 49 jest wątpliwa, a 50 i więcej to wynik pozytywny.

Wyniki reakcji można uznać za wiarygodne tylko wtedy, gdy surowicę hiperimmunizowaną zbada się pod kątem specyficznego działania neutralizującego. W tym celu najpierw określa się miano przeciwciał neutralizujących w tej surowicy lub jej wskaźnik neutralizacji w reakcji z wirusem homologicznym.

Izolacja rabdowirusów metodą łysinkową. Metoda ta jest specyficzna, służy do izolacji, wstępnego typowania i selekcji rabdowirusów karpia i pstrąga w obecności swoistych surowic odpornościowych w celu identyfikacji wirusa.

W hodowlach komórkowych pod powłoką agarową w obecności wirusa w materiale testowym tworzą się okrągłe kolonie (łysinki).

W warunkach aseptycznych tkankę nerek, wątroby, śledziony i płyn z jamy brzusznej pobiera się za pomocą pipety Pasteura i przenosi do butelki z pożywką zawierającą 500 IU (mcg)/ml antybiotyków w stosunku 1:10. Inkubować przez 60-90 minut w temperaturze 18-22°C, następnie wirować przy 2-3 tys. obr/min przez 10 minut. Supernatant rozcieńcza się pożywką 1:10 (rozcieńczenie 1:100). Do zakażenia hodowli komórkowych stosuje się supernatanty z obu rozcieńczeń.

Do badania wybrano 3-dniową ciągłą hodowlę komórkową hodowaną na materacach z dobrze określoną monowarstwą w ilości 2 materacy na każde rozcieńczenie materiału patologicznego i 2 materace do kontroli. Pożywkę usuwa się z butelek i dodaje 2 ml pożywki bez surowicy płodowej. Następnie dodaje się 0,2 ml materiału testowego i pozostawia do adsorbcji wirusa przez 60 minut w temperaturze optymalnej dla wirusów zakażających ryby (dla wirusów karpia - 24-26°C i dla wirusów pstrąga - 16-18°C).

Kontrolę umieszcza się na 2 materacach z kulturami komórkowymi po 0,2 ml każdy, zawierającymi 100 TCD 50/ml znanego wirusa i w 2 - 0,2 ml pożywki bez wirusa.

Po 60 minutach płyn usuwa się z fiolek. Wzdłuż ścianki naprzeciw monowarstwy dodać 5 ml powłoki agarowej podgrzanej do temperatury 40-42°C do butelki o pojemności 50 ml podgrzanej do temperatury 40-42°C (w przypadku izolacji wirusa HCV - nie więcej niż 38°C). Materace są zwinięte jednowarstwowo i pokryte czarnym papierem. Po 15-20 minutach materace przekazuje się do inkubacji w temperaturze optymalnej dla badanych wirusów. Materace układa się powłoką agarową do góry. Jeżeli wirus nie jest znany, hodowle przechowuje się w dwóch temperaturach – 14-18 i 22-24°C.

Zainfekowane hodowle komórkowe są widoczne na białym tle. Jeśli w badanej hodowli komórkowej znajduje się wirus, najpierw na różowo-matowym tle kultury pojawiają się przezroczyste kropki. Następnie powiększają się, tworząc okrągłe przezroczyste kolonie - łysinki, których obecność wskazuje na obecność rabdowirusów w materiale patologicznym.

Za pomocą pipety Pasteura pobrać kawałek płytki na granicy części dotkniętej i zdrowej w taki sposób, aby uwzględnić nie tylko warstwę agaru, ale także warstwę komórek. Wybrany kawałek umieszcza się w probówce z 1 ml pożywki wzrostowej, zamraża w temperaturze -20°C i trzyma przez 60 minut. W przypadku dużej liczby łysinek (cała warstwa komórek jest przezroczysta) badania powtarza się w rozcieńczeniach 10 -3 i 10 -4.

Łystki o średnicy 3-8 mm rabdowirusa karpia na ciągłej hodowli EPC i FHM, inkubowanej w temperaturze 24-26°C, pojawiają się w 4-7 dniu.

W przypadku braku łysinek i obecności CPD w hodowlach komórkowych przeprowadza się dodatkowe badania na płynie hodowlanym zawierającym wirusa w rozcieńczeniach 10 -2 -10 -3 (2-3 pasaże). Dodatkowe metody identyfikacji wirusów obejmują: metodę przeciwciał fluorescencyjnych; określenie wrażliwości wirusa na chloroform, eter, wartość pH, ogrzewanie; badanie morfologii wirusów pod mikroskopem elektronowym.

Praca na kursie

„Metody wirusologii klinicznej”

Wstęp

Diagnostykę laboratoryjną infekcji wirusowych przeprowadza się głównie z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej, wrażliwych hodowli komórkowych oraz metod immunologicznych. Z reguły wybiera się jedną metodę diagnozy w zależności od stadium infekcji wirusowej. Na przykład wszystkie trzy podejścia mogą być przydatne w diagnozowaniu ospy wietrznej, ale skuteczne zastosowanie technik mikroskopowych i hodowli komórkowych zależy od możliwości pobrania zadowalających próbek na stosunkowo wczesnym etapie choroby.

Powodzenie diagnostyki wirusowej w dużej mierze zależy od jakości uzyskanych próbek. Z tego powodu personel laboratorium musi być bezpośrednio zaangażowany w pobieranie niezbędnych próbek. Charakterystykę próbek oraz sposoby ich dostarczenia do laboratorium opisują Lennett, Schmidt, Christ i in.

Większość odczynników i instrumentów stosowanych w diagnostyce laboratoryjnej można kupić w różnych firmach. W większości przypadków ten sam odczynnik jest produkowany jednocześnie przez kilka firm. Z tego powodu nie wskazaliśmy poszczególnych firm, chyba że odczynnik dostarcza tylko jedna firma. We wszystkich pozostałych przypadkach należy zapoznać się z ogólną listą dostawców wskazaną w tabeli. 1.

Naszym celem nie było przedstawienie kompleksowego opisu wszystkich obecnie dostępnych metod diagnozowania ludzkich infekcji wirusowych. Przede wszystkim scharakteryzowaliśmy główne metody. W miarę zdobywania doświadczenia w samodzielnej pracy te podstawowe techniki można wykorzystać do rozwiązywania bardziej złożonych problemów.

1. Mikroskopia elektronowa

Do diagnostyki infekcji wirusowych pod mikroskopem elektronowym można zastosować cienkie skrawki dotkniętej tkanki. Najpopularniejszym materiałem używanym w mikroskopii elektronowej jest kał lub płyn.

Tabela 1. Lista firm dostarczających odczynniki i sprzęt

pęcherzyki charakterystyczne dla niektórych chorób, takich jak ospa wietrzna. Analizując taki materiał, wirusy można wykryć za pomocą barwienia negatywnego, w wyniku czego powstaje materiał o dużej gęstości elektronowej wyznaczający składniki wirionu. Metoda jest skuteczna, gdy stężenie wirusa w badanych próbkach, np. w kale lub płynie pęcherzykowym, jest wysokie. W przypadkach, gdy zawartość cząstek wirusa w próbkach jest niska, prawdopodobieństwo wykrycia wirusa można zwiększyć poprzez zatężenie wirusa poprzez ultrawirowanie lub agregację go ze specyficznymi przeciwciałami. Ta ostatnia metoda jest również wygodna do identyfikacji wirusów. W tym miejscu opiszemy metodę mikroskopii elektronowej służącą do diagnostyki zakażenia rotawirusami oraz metodę mikroskopii immunoelektronowej na przykładzie wykrywania swoistych przeciwciał przeciwko parwowirusom. Metody mikroskopii elektronowej są opisane bardziej szczegółowo przez Fielda.

2.1 Bezpośrednie badanie kału pod mikroskopem elektronowym

1. Zanurz końcówkę pipety Pasteura w kale i pobierz wystarczającą ilość materiału, aby uzyskać rozmaz o średnicy 1 cm.

2. Zawiesić rozmaz kału w barwniku o ujemnym kontraście mikroskopu elektronowego, aż do uzyskania półprzezroczystej zawiesiny. Ujemny barwnik kontrastowy to 2% roztwór kwasu fosforowolframowego w wodzie destylowanej.

3. W celu uzyskania próbki z mikroskopu elektronowego kroplę zawiesiny umieszcza się na siatce mikroskopu elektronowego pokrytej warstwą węgla i formywaru. Podczas tej operacji siatkę przytrzymuje się za pomocą cienkiej pęsety.

4. Lek pozostawia się w powietrzu przez 30 s.

5. Nadmiar płynu usuwa się dotykając krawędzi szkła bibułą filtracyjną.

6. Lek suszy się na powietrzu.

7. W razie potrzeby inaktywuje się żywego wirusa poprzez naświetlanie obu stron siatki światłem ultrafioletowym o natężeniu 440 000 μW-s/cm2. W tym przypadku stosuje się krótkofalową lampę ultrafioletową z filtrem. Lampa powinna znajdować się w odległości 15 cm od siatki; Czas naświetlania dla każdej strony wynosi 5 minut.

8. Wiriony rotawirusa można scharakteryzować pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy powiększeniu od 30 000 do 50 000.

2.2 Mikroskopia immunoelektronowa

Opisana poniżej metoda mikroskopii immunoelektronowej jest tylko jedną z wielu podobnych metod immunologicznych. Do badania przeciwciał swoistych dla wirusa stosuje się dodatkowo metodę polegającą na wiązaniu się z mikroskopijną siecią białka A. Stężenie robocze przeciwciał przeciwwirusowych ustala się metodą prób i błędów w zakresie od 1/10 do 1/1000. Wskazane przez nas stężenie jest zwykle stosowane w rutynowej pracy. Aby uzyskać optymalne wyniki interakcji przeciwciał z wirusem, w ten sam sposób miareczkuje się surowicę zawierającą parwowirusa.

1. 10 µl surowicy odpornościowej przeciwko ludzkiemu parwowirusowi rozcieńcza się 100 razy PBS. Roztwór ogrzewa się w łaźni wodnej do 56°C.

2. Rozpuścić w zwykły sposób 10 ml 2% agarozy w PBS i ochłodzić do 56°C w łaźni wodnej.

3. W temperaturze 56°C zmieszać 1 ml rozcieńczonej surowicy odpornościowej z 1 ml 2% agarozy.

4. Przenieść 200 µl powstałej mieszaniny do dwóch dołków 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania.

5. Agarozę pozostawia się do zestalenia w temperaturze pokojowej. Tabletkę można przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka tygodni, jeśli jest zabezpieczona taśmą klejącą.

6. Dodać 10 µl surowicy zawierającej parwowirusa do dołka zawierającego mieszaninę agarozy i surowicy odpornościowej.

7. Siatkę mikroskopu elektronowego z przygotowaną powłoką węglowo-formwarową umieszcza się po mniej błyszczącej stronie na kropli surowicy.

8. Siatkę przechowuje się przez 2 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze.

9. Za pomocą cienkiej pęsety wyjmij siatkę i nałóż kroplę 2% kwasu fosforowolframowego na powierzchnię siatki, która miała kontakt z serum.

10. Po 30 s zmywa się nadmiar farby, suszy preparat i inaktywuje wirusa.

Zagregowane cząstki wirusa bada się pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy powiększeniu od 30 000 do 50 000.

3. Identyfikacja antygenów wirusowych

Wirusy znajdujące się w tkankach lub płynach tkankowych można zidentyfikować na podstawie białek specyficznych dla wirusa, stosując reakcję antygen-przeciwciało. Produkt reakcji antygen-przeciwciało bada się przy użyciu znacznika wprowadzanego bezpośrednio do przeciwciał przeciwwirusowych lub do przeciwciał skierowanych przeciwko przeciwciałom specyficznym dla wirusa. Przeciwciała można znakować fluoresceiną, radioaktywnym jodem lub enzymem rozszczepiającym substrat, powodując zmianę koloru. Ponadto do identyfikacji wirusa wykorzystuje się reakcję hemaglutynacji. W codziennej praktyce opisane metody stosowane są głównie do wykrywania antygenów wirusa zapalenia wątroby typu B we krwi oraz poszukiwania antygenów różnych wirusów wywołujących różne choroby układu oddechowego.

Obecnie wiele firm zajmuje się diagnostyką erytrocytową, radioaktywną i enzymatyczną, w tym do wykrywania wirusa zapalenia wątroby typu B. Nie uważamy za wskazane nakreślanie metod pracy z tą diagnostyką: wystarczy postępować zgodnie z załączoną instrukcją. Poniżej skupimy się na metodzie immunofluorescencyjnej służącej do identyfikacji syncytialnego wirusa oddechowego w wydzielinie nosowo-gardłowej.

3.1 Identyfikacja syncytialnego wirusa oddechowego w wydzielinie nosowo-gardłowej metodą immunofluorescencji

Metodę otrzymywania preparatów wydzieliny nosowo-gardłowej opisali Gardner i McQuillin. W warunkach laboratoryjnych operację tę przeprowadza się dwuetapowo. Najpierw na szklanym szkiełku przygotowuje się rozmaz śluzu nosowo-gardłowego. Powstałe rozmazy można przechowywać w temperaturze -20°C przez wiele miesięcy. W drugim etapie rozmazy są barwione w celu wykrycia antygenu syncytialnego wirusa oddechowego. W tym celu wykorzystuje się metodę immunofluorescencji pośredniej.

3.1.1 Przygotowanie preparatów wydzieliny nosowo-gardłowej

1. Śluz ze specjalnych kleszczyków zmywa się 1-2 ml PBS i przenosi do probówki wirówkowej.

2. Wiruj przez 10 minut przy 1500 obr/min w wirówce stołowej.

3. Supernatant odsącza się.

4. Osad komórkowy ostrożnie zawiesza się w 2-3 ml PBS, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Aby to zrobić, użyj pipety Pasteura z szeroką szyjką.

5. Powstałą zawiesinę przenosi się do probówki.

6. Do zawiesiny dodać kolejne 2-4 ml PBS i wymieszać poprzez pipetowanie. Duże skrzepy śluzu są usuwane.

7. Wiruj przez 10 minut przy 1500 obr/min w wirówce stołowej.

8. Supernatant odrzuca się, osad ponownie zawiesza w takiej objętości PBS, aby powstałą zawiesinę łatwo było oddzielić od ścianek probówki.

9. Powstałą zawiesinę nanosi się na oznaczone szkiełko.

10. Szkło suszy się na powietrzu.

Utrwalić w acetonie przez 10 minut w temperaturze 4°C.

12. Po utrwaleniu szkło ponownie suszy się na powietrzu.

13. Powstałe preparaty natychmiast barwi się lub przechowuje w temperaturze -20°C.

3.1.2. Technika barwienia

1. Wydrukuj i rozcieńcz komercyjną antysurowicę RSV w PBS do zalecanego stężenia roboczego.

2. Pipetą Pasteura nanieść na przygotowany preparat jedną kroplę antysurowicy.

3. Lek umieszcza się w wilgotnej komorze.

4. Lek inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C.

5. Próbki dokładnie przemywa się PBS w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał w specjalnym zbiorniku.

6. Próbki przemywa się PBS na trzy zmiany po 10 minut każda.

7. Wysuszyć próbki, usunąć nadmiar PBS bibułą filtracyjną i wysuszyć na powietrzu.

Wirusy, w przeciwieństwie do bakterii, rozmnażają się wyłącznie w żywych komórkach. W tym zakresie hodowlę wirusów można prowadzić na poziomie ciała zwierzęcia doświadczalnego (zarodek kurze, jako organizm rozwijający się, zaliczany jest do zwierzęcia doświadczalnego) lub żywej komórki wyhodowanej poza organizmem, tj. na poziomie hodowli komórkowej.

Wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych. Jedną z metod izolacji i hodowli wirusów jest infekowanie zwierząt laboratoryjnych. Służą do izolacji wirusów, które nie powodują rozwoju zmian cytopatycznych w hodowlach komórkowych i nie rozmnażają się w zarodkach kurzych. Wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych umożliwia również identyfikację charakteru infekcji wirusowej na podstawie zespołu objawów klinicznych. Jako zwierzęta laboratoryjne wykorzystuje się najczęściej białe myszy, chomiki, świnki morskie i króliki, w zależności od celu pracy i rodzaju badanych wirusów. Wśród większych zwierząt wykorzystuje się małpy różnych gatunków i niektóre inne zwierzęta. Wykorzystywane ptaki to kurczaki, gęsi i kaczki. W ostatnich latach coraz częściej pojawiają się nowonarodzone zwierzęta (bardziej wrażliwe na wirusy), „zwierzęta sterylne” (wyrwane z macicy i trzymane w sterylnych warunkach przy użyciu sterylnego powietrza i sterylizowanej paszy) oraz zwierzęta czystych linii o znanym dziedziczności (zwierzęta wsobne lub liniowe). często używany.

Do doświadczenia włącza się wyłącznie zdrowe zwierzęta, najlepiej z jednej odchowalni i jednej partii. Temperatura ciała jest mierzona w tym samym czasie, ponieważ występują dzienne wahania. Materiał do badań podaje się z uwzględnieniem tropizmu wirusów do określonych tkanek. Tak więc, aby wyizolować wirusy neutrotropowe, materiał wstrzykuje się do mózgu, aby wyizolować wirusy pneumotropowe - przez nos (w lekkim znieczuleniu eterowym).

U zwierząt laboratoryjnych po zakażeniu materiałem zawierającym wirusa ważne jest terminowe i prawidłowe pobranie materiału do dalszych badań oraz zachowanie zasad aseptyki. Wyniki izolacji wirusa uważa się za pozytywne, jeżeli po odpowiednim okresie inkubacji u zwierzęcia wystąpią objawy zakażenia.

Wykorzystanie zarodków kurzych. Wiele patogennych wirusów ludzi i zwierząt może namnażać się w tkankach zarodka, jego błonach i woreczku żółtkowym. W tym przypadku ważna jest selektywność wirusów w stosunku do określonej tkanki: wirusy ospy dobrze rozmnażają się i gromadzą w komórkach błony kosmówkowo-moczniowej, wirus świnki w owodni, wirusy grypy w owodni i omoczni oraz wirus wścieklizny w woreczku żółtkowym.

Hodowla wirusów w rozwijających się zarodkach ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami: gęsta otoczka dość niezawodnie chroni wewnętrzną zawartość przed drobnoustrojami; w przypadku zakażenia zarodków kurzych uzyskuje się większy uzysk materiału zawierającego wirusa niż w przypadku innych metod hodowli; metoda infekowania zarodków kurzych jest prosta i dostępna dla każdego laboratorium wirusologicznego; zarodki mają wystarczającą żywotność i odporność na patogeny zewnętrzne. Jednak zarodki kurze nie zawsze są wolne od utajonych infekcji wirusowych i bakteryjnych. Trudno jest zaobserwować dynamikę zmian patologicznych zachodzących w zarodku po zakażeniu wirusem. Podczas otwierania zakażonych zarodków często nie wykrywa się żadnych widocznych zmian, a wirusa wykrywa się za pomocą reakcji hemaglutynacji i innymi metodami. W zakażonych zarodkach nie jest możliwe monitorowanie wzrostu miana przeciwciał. Metoda nie jest odpowiednia dla wszystkich wirusów.

Do badań wirusologicznych wykorzystuje się zarodki w wieku 7-12 dni, które pozyskiwane są z ferm drobiu. Zarodki można hodować w zwykłym termostacie, na dnie którego umieszcza się tace z wodą w celu nawilżania powietrza. Temperatura w termostacie powinna wynosić 37°C, a wilgotność powietrza 60-65%. Wybierz duże, czyste (ale nieumyte), zapłodnione jaja od białych kur, przechowywane nie dłużej niż 10 dni w temperaturze 5-10 ° C. Zapłodnione jaja można rozpoznać po obecności krążka zarodkowego, który po zbadaniu za pomocą owoskopu wygląda jak ciemna plama.

Podczas pracy z wirusami można stosować różne metody infekowania zarodków, jednak największym praktycznym zastosowaniem jest aplikowanie wirusa na błonę kosmówkowo-moczniową, wprowadzając go do jamy omoczniowej, owodniowej i woreczka żółtkowego

(ryc. 10.5). Wybór metody zależy od właściwości biologicznych badanego wirusa.

Ryż. 10,5.

Przed infekcją żywotność zarodka określa się za pomocą owoskopu. Żywe zarodki są mobilne, pulsacja naczyń błon jest wyraźnie widoczna. Podczas owoskopii granice worka powietrznego lub położenie zarodka, które określa jego cień na skorupie, zaznacza się na skorupie prostym ołówkiem.

Zarodki kurze infekuje się w pudełku w ściśle aseptycznych warunkach, przy użyciu narzędzi sterylizowanych przez gotowanie.

Do zakażania błony kosmówkowo-omoczniowej najbardziej odpowiednie są 12-dniowe zarodki. Do infekcji stosuje się zarodki w wieku 10-11 dni w jamie omoczniowej, zarodki w wieku 7-11 dni w jamie owodniowej, a zarodki w wieku 7 dni w worku żółtkowym.

Jaja z zakażonymi zarodkami umieszcza się na stojakach tępym końcem do góry. Temperatura i okres inkubacji zależą od właściwości biologicznych zaszczepionego wirusa. Żywotność zarodków jest codziennie monitorowana pod owoskopem. Zarodki, które zmarły pierwszego dnia po zakażeniu w wyniku urazu, nie są badane.

Przed pobraniem materiału zarodki schładza się w temperaturze 4°C przez 18–20 godzin, aby zwęzić naczynia krwionośne i zapobiec krwawieniu podczas sekcji. Zarodki wypreparowuje się w pudełku z zachowaniem zasad aseptyki.

Płyn omoczniowy pobiera się pipetą, sterylność kontroluje się poprzez zaszczepienie w bulionie cukrowym lub mięsno-peptonowym, sprawdza się na obecność wirusa w reakcji hemaglutynacji i przechowuje w stanie zamrożonym w temperaturze 4°C.

Aby uzyskać płyn owodniowy, najpierw odsysa się płyn omoczniowy, następnie chwyta się pęsetą błonę owodniową, lekko ją unosząc i za pomocą pipety Pasteura odsysa się płyn owodniowy.

Podczas badania zmian w błonie kosmówkowo-omoczniowej przecina się ją nożyczkami i całą zawartość przelewa się przez otwór na szalkę Petriego. Błona kosmówkowo-omoczniowa pozostaje wewnątrz muszli i jest usuwana pęsetą na szalkę Petriego z roztworem soli fizjologicznej. Tutaj jest ono myte, prostowane i badany jest charakter zmian ogniskowych na ciemnym tle.

Aby uzyskać błonę owodniową, należy rozciąć worek owodniowy, w którym znajduje się zarodek, uwolnić go od zarodka i zbadać pod kątem uszkodzeń.

Aby uzyskać błonę żółtkową, przecina się kosmówkę-alantois, odsysa się płyn omoczniowy i owodniowy, płód usuwa się pęsetą, oddziela pępowiną, pobiera się woreczek żółtkowy i umieszcza na szalce Petriego. Sprawdź sterylność i sprawdź, czy nie ma uszkodzeń. W przypadku konieczności pobrania żółtka można je odssać strzykawką bez usuwania pęcherzyka żółtkowego.

Obecność wirusa w płynie omoczniowym i owodniowym zakażonego zarodka określa się na podstawie reakcji hemaglutynacji. Płyny zarodków z dodatnim wynikiem hemaglutynacji, po sprawdzeniu sterylności, łączy się i miareczkuje w reakcji ekstensywnej hemaglutynacji.

W przypadku niewielkiej ilości wirusa lub braku możliwości jego wykrycia w materiale badawczym, kolejne pasaże przeprowadza się na zarodkach kurzych. Jeżeli po trzech kolejnych pasażach na zarodkach wirus nie zostanie wykryty w materiale testowym, wynik uważa się za ujemny.

Zastosowanie kultur komórkowych. Hodowla komórek poza organizmem wymaga spełnienia szeregu warunków. Jednym z nich jest ścisłe przestrzeganie sterylności podczas pracy, gdyż stosowane pożywki stanowią doskonały substrat odżywczy także dla bakterii i grzybów. Komórki tkankowe są bardzo wrażliwe na sole metali ciężkich. Dlatego też należy przywiązywać szczególną wagę do jakości poszczególnych składników wchodzących w skład roztworów soli i pożywek hodowlanych, a także do sposobu obróbki naczyń i korków gumowych stosowanych w hodowli komórkowej.

Jednym z warunków udanej pracy z ogniwami jest wysokiej jakości woda destylowana (sprawdzana dwa razy w tygodniu). Do pracy z ogniwami używa się wody destylowanej lub dejonizowanej. Najlepsze gorzelnie to urządzenia wykonane ze szkła lub stali stopowej: jony metali ciężkich, które są toksyczne dla ogniw, nie są wypłukiwane z takiego sprzętu. Woda dejonizowana produkowana jest w specjalnych instalacjach, w których woda jest oczyszczana z soli poprzez sekwencyjne przepuszczanie przez kolumny z żywicami anionowymi i kationowymiennymi.

Podczas hodowli komórek szczególnie duże wymagania stawiane są przygotowaniu i sterylizacji naczyń i zatyczek. W wielu przypadkach to niewłaściwe mycie i sterylizacja powodują, że komórki nie przyczepiają się do szkła lub następuje szybka degeneracja monowarstwy komórek.

Do wzrostu i reprodukcji komórek poza organizmem wymagany jest złożony zestaw czynników fizykochemicznych: pewna temperatura, stężenie jonów wodorowych, związków nieorganicznych, węglowodanów, aminokwasów, białek, witamin, tlenu i dwutlenku węgla, dlatego dla do hodowli wirusów w kulturach komórkowych stosuje się złożone pożywki. Ze względu na charakter składników wchodzących w skład pożywek dzieli się je na dwie grupy.

• 1. Pożywki będące mieszaniną roztworów soli fizjologicznej (Hanks, Earle itp.) i składników naturalnych (surowica krwi zwierzęcej i ludzkiej, hydrolizat albuminy). Ilość każdego z tych składników w różnych recepturach podłoży jest różna.
• 2. Pożywki syntetyczne i półsyntetyczne, składające się z roztworów soli (Earl, Hanks i in.) z dodatkiem aminokwasów, witamin, koenzymów i nukleotydów (pożywki Eagle, 199 i in.). W podłożach syntetycznych komórki mogą istnieć w stanie żywotnym przez krótki czas (do 7 dni). Aby utrzymać je w stanie nadającym się do życia przez dłuższy okres czasu, a także stworzyć lepsze warunki do wzrostu i rozmnażania komórek, do pożywek syntetycznych dodaje się surowicę krwi zwierzęcej (krowy, cielęta itp.).

Do izolacji wirusów można zastosować różne metody hodowli komórek poza organizmem. Jednak obecnie największe praktyczne zastosowanie znajdują hodowle jednowarstwowe pierwotnych trypsynizowanych i ciągłych linii komórkowych. Hodowle komórkowe jednowarstwowe hoduje się w szklanych, płaskościennych naczyniach materacowych o pojemności 1 litra, 250 i 100 ml lub w konwencjonalnych probówkach bakteriologicznych, poddanych odpowiedniej obróbce.

W przypadku stosowania pierwotnych trypsynizowanych kultur komórkowych, istotą metody jest zniszczenie połączeń międzykomórkowych w tkankach za pomocą enzymów proteolitycznych i oddzielenie komórek w celu wyhodowania monowarstwy na powierzchni szkła. Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy zarodków ludzkich i zwierzęcych, zwierząt i ptaków poddanych ubojowi, a także te pobrane od ludzi podczas operacji. Wykorzystuje się tkanki zdegenerowane normalne i złośliwe, nabłonkowe, fibroblastyczne i mieszane. Zdolność do namnażania komórek pobranych z organizmu jest ściśle powiązana ze stopniem zróżnicowania tkanek. Im mniej zróżnicowana tkanka, tym intensywniejsza jest zdolność proliferacyjna jej komórek in vitro. Dlatego komórki z tkanek embrionalnych i nowotworowych są znacznie łatwiejsze do hodowli poza organizmem niż normalne komórki pochodzące od dorosłych zwierząt.

Hodowle bada się codziennie pod mikroskopem o małym powiększeniu w celu określenia wzorca ich wzrostu. Jeśli komórki nie rozmnażają się, są okrągłe, ziarniste, ciemne i odpadają od szkła, oznacza to, że szkło jest źle przetworzone lub składniki pożywki są toksyczne.

Oprócz pierwotnych tkanek trypsynizowanych, do hodowli wirusów powszechnie stosuje się ciągłe hodowle komórkowe, tj. hodowle komórek zdolnych do rozmnażania się poza organizmem w nieskończoność. Najczęściej stosowane hodowle komórkowe to te uzyskane z normalnych i nowotworowych tkanek ludzkich. Linia komórkowa HeLa uzyskana z guza szyjki macicy, Hep-2 z raka krtani i KV z tkanki raka jamy ustnej stała się powszechnie znana. Takie hodowle komórkowe przygotowuje się również z normalnych tkanek zwierzęcych - nerek zarodków małpy, królika i świni (Tabela 10.1).

Aby ponownie zaszczepić przeszczepione komórki, pożywkę należy odsysać pipetą i wylewać. Powstała cienka warstwa komórek jest niszczona roztworem trypsyny, a uwolnione w ten sposób komórki przenoszone są do nowego naczynia ze świeżym roztworem odżywczym, gdzie ponownie tworzy się monowarstwa komórek.

Wskaźnikiem obecności wirusa w zakażonych hodowlach komórkowych może być:

• a) rozwój specyficznej degeneracji komórek;
• b) wykrywanie wtrąceń wewnątrzkomórkowych;
• c) wykrywanie specyficznego antygenu metodą immunofluorescencji;
• d) dodatnia reakcja hemadsorpcji;
• e) dodatnia reakcja hemaglutynacji;
• e) tworzenie się płytek.

Tabela 10.1

Lista najczęściej stosowanych przeszczepialnych kultur komórkowych

Aby zidentyfikować specyficzną degenerację w zakażonych kulturach, komórki bada się codziennie pod mikroskopem o małym powiększeniu. Wiele wirusów namnażając się w komórkach powoduje ich degenerację, czyli tzw. mają działanie cytopatogenne (CPE) (ryc. 10.6).

Ryż. 10.6.

Czas rozwoju i charakter zmian cytopatycznych w zakażonych hodowlach komórkowych są zdeterminowane właściwościami i dawką zaszczepionego wirusa, a także właściwościami i warunkami hodowli komórkowej. Niektóre wirusy powodują CPD w ciągu pierwszego tygodnia po zakażeniu (ospa, polio, wirusy Coxsackie B itp.), inne - po 1-2 tygodniach. po infekcji (adenowirusy, wirusy paragrypy, ECHO itp.).

Wirusy powodują zmiany cytopatyczne trzech głównych typów: tworzenie wielojądrzastych komórek olbrzymich i symplastów, które są wynikiem fuzji cytoplazmy wielu komórek; zwyrodnienie komórek okrągłych, które występuje w wyniku utraty połączeń międzykomórkowych i zaokrąglenia komórek; rozwój ognisk proliferacji komórek, składających się z kilku warstw komórek.

Kiedy niektóre wirusy namnażają się w hodowlach komórkowych, w cytoplazmie lub jądrze dotkniętych komórek tworzą się wtręty wewnątrzkomórkowe. W celu identyfikacji wtrętów hodowle komórkowe hoduje się na szklanych płytkach w probówkach, infekując wirusem, a po pewnym okresie inkubacji przygotowuje się preparaty barwiąc je konwencjonalnymi barwnikami.

Aby wykryć specyficzny antygen w zakażonych hodowlach komórkowych, preparaty przygotowuje się w taki sam sposób, jak do wykrywania wtrętów, stosując MFA.

Metoda łysinkowa opiera się na tworzeniu przebarwionych obszarów składających się ze zdegenerowanych (martwych) komórek w monowarstwie komórek zakażonych wirusem pod powłoką agarową. Obszary te, zwane łysinkami, to kolonie wirusa, zwykle utworzone z pojedynczej cząsteczki wirusa.

W przypadku braku zmian cytopatycznych, wtrąceń wewnątrzkomórkowych, tworzenia się płytek, negatywnych reakcji hemadsorpcji i hemaglutynacji w hodowlach komórkowych zakażonych materiałem testowym, przeprowadza się dwa kolejne pasaże. W przypadku braku tych zmian w końcowym pasażu wynik izolacji wirusa uważa się za ujemny.

Do wykrywania wirusów w materiale zakaźnym można zastosować następujące metody.

Mikroskopijny:

• a) wirusoskopia;
• b) wykrywanie wtrąceń wewnątrzkomórkowych.

Immunologiczny:

• a) immunologiczna mikroskopia elektronowa;
• b) immunofluorescencja;
• c) hemaglutynacja;
• d) hemadsorpcja.

Identyfikacja wirusów odbywa się metodami immunologicznymi, obejmującymi następujące reakcje:

• a) hamowanie hemaglutynacji;
• b) opóźnienia w hemadsorpcji;
• c) wiązanie dopełniacza;
• d) neutralizacja;
• e) wytrącanie w żelu agarowym.

Metody mikroskopowe. Za pomocą mikroskopu świetlnego można wykryć tylko duże wirusy większe niż 150 nm. Rozpoznanie mniejszych wirusów możliwe jest jedynie pod mikroskopem elektronowym. Do wykrywania dużych wirusów można zastosować mikroskopię świetlną, kontrastowo-fazową i fluorescencyjną.

Podczas infekcji wirusowych w zakażonych komórkach rozwijają się osobliwe wtręty. Niektórym infekcjom towarzyszy tworzenie się wtrętów w cytoplazmie dotkniętych komórek (szczepionka przeciwko wściekliźnie, ospie), innym - w cytoplazmie i jądrze (odra, ospa naturalna i wietrzna, choroby adenowirusowe). Inkluzje mają różny charakter, strukturę, kształt i wielkość od 0,25 do 25 mikronów. Według współczesnych danych, w niektórych infekcjach wtręty są miejscem namnażania się wirusa i reprezentują jego nagromadzenie w otoczeniu substancji komórkowych, w innych są produktem degeneracji komórek.

Inkluzje można wykryć w wybarwionych odciskach narządów i tkanek, zeskrobinach komórek, skrawkach histologicznych zakażonej tkanki i preparatach hodowli komórkowych zakażonych wirusem. Kolorowanie często odbywa się metodą Romanovsky-Giemsa. Do barwienia tą metodą preparaty utrwala się w mieszaninie Dubosc-Brazil-Bouin składającej się z kwasu pikrynowego, formaliny, alkoholu i kwasu octowego. Wtręty wewnątrzkomórkowe występujące w większości infekcji wirusowych mają charakter oksyfilny i barwią się na różowo lub liliowo metodą Romanovsky’ego-Giemsy.

Immunologiczne metody diagnostyki infekcji wirusowych. W ostatnich latach metody te stały się wiodącymi metodami diagnostyki laboratoryjnej infekcji wirusowych. Wynika to w dużej mierze ze względów ekonomicznych, gdyż klasyczne metody analizy wirusologicznej są dość drogie. Dodatkowo czas trwania badań metodami wirusologicznymi (tygodnie), nawet jeśli okażą się one dość skuteczne, czyni je retrospektywnymi.

Metody immunologiczne stosowane są zarówno do wykrywania antygenów wirusowych w różnych biosubstratach i obiektach środowiska, jak i do serodiagnostyki – wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom wirusowym w surowicy krwi osób chorych i zwierząt laboratoryjnych. Ponadto do identyfikacji wirionów niezbędne są badania immunologiczne.

Wirusy wchodząc w interakcję z organizmem powodują powstawanie przeciwciał, które zaadsorbowane na wirionach zapobiegają wnikaniu wirionów do komórek i rozwojowi działania cytopatycznego (CPE); neutralizować śmiertelne działanie wirusów podczas ich rozmnażania w zarodkach kurzych i ciele zwierząt; inaktywują hemaglutyniny i neuraminidazy wirionu, zapobiegając reakcji hemaglutynacji (RHA) i reakcji hemadsorpcji (RGads) na komórkach dotkniętych wirusem. Te przeciwciała neutralizujące wirusa powodują również aglutynację i wytrącanie cząstek wirusa, a powstałe kompleksy immunologiczne wiążą dopełniacz. Dlatego do identyfikacji wirionów wykorzystuje się klasyczną reakcję neutralizacji (PH) na hodowlach komórkowych, zarodkach kurzych i zwierzętach oraz jej modyfikacje: reakcję hamowania hemaglutynacji (HAI); reakcja hamowania hemadsorpcji (RTGads). Te same reakcje wykorzystuje się w serodiagnostyce infekcji wirusowych w celu wykrycia przeciwciał neutralizujących wirusa w surowicy pacjentów na podstawie znanego antygenu wirusowego (diagnosticum).

Metoda mikroskopii immunoelektronowej (IEM). Mikroskopia elektronowa odgrywa obecnie ważną rolę w badaniu wirusów. Podstawą współczesnej klasyfikacji wirusów są dane z mikroskopu elektronowego.

Nowym etapem w rozwoju badań wirusów za pomocą mikroskopu elektronowego jest zastosowanie technik mikroskopii immunoelektronowej. Dzięki tej metodzie możliwe stało się nie tylko bezpośrednie wykrywanie wirusów, ale także ich identyfikacja, a także szybkie serotypowanie szczepów wirusowych i miareczkowanie przeciwko nim przeciwciał. IEM nabrało dużego znaczenia w określaniu lokalizacji antygenów wirusowych wewnątrz komórek makroorganizmu.

Niewątpliwą zaletą IEM jest jego wysoka czułość w porównaniu do konwencjonalnych metod mikroskopii elektronowej.

Kiedy antygen wirusa lub jego składnik wchodzi w kontakt z homologiczną surowicą odpornościową, tworzy się kompleks przeciwciało-antygen. Zjawisko to stanowi podstawę techniki stosowanej do wykrywania i identyfikacji antygenów wirusowych lub przeciwciał przeciwko nim. To właśnie te kompleksy antygenów z przeciwciałami po ujemnym kontraście można zaobserwować w mikroskopie elektronowym. W diagnostyce klinicznej materiał antygenowy nie wymaga dokładnego oczyszczania. Zatem w przypadku wykrycia wirusa grypy można zbadać surowy płyn omoczniowy. Obecnie uważa się, że do IEM nadaje się prawie każdy rodzaj materiału klinicznego. Do celów diagnostycznych można stosować zwykłą surowicę niefrakcjonowaną, a także surowice rekonwalescencyjne. Należy zauważyć, że na ostateczne wyniki duży wpływ ma stosunek ilości antygenu i przeciwciał. Gdy występuje nadmiar antygenu, obserwuje się obfitość cząstek; aglomeraty w tym przypadku będą nieliczne. Jeśli przeciwciał jest nadmiar, cząsteczki wirusa są otoczone grubą warstwą, co prawie uniemożliwia identyfikację drobnych szczegółów strukturalnych wirionu; liczba jednostek jest również niewielka. Przy optymalnym stosunku ilości antygenu i przeciwciał agregaty stają się większe z dobrym obrazem szczegółów wirionów. Z powyższych względów wskazane jest stosowanie surowicy odpornościowej w kilku rozcieńczeniach.

Na siatkę nośną nakładana jest folia nośna wykonana z palladu. W przypadku stosowania palladu w niskich stężeniach oraz w celu poprawy właściwości adsorpcyjnych podłoża wzmacnia się go węglem. W tym celu węgiel natryskuje się w próżni na gotowe suche podłoże filmowe na siatce mikroskopu elektronowego. Grubość folii podkładowej i wzmacniającej warstwy węgla ma znaczący wpływ na kontrast i obraz drobnych szczegółów obiektu. Każdy badacz indywidualnie określa grubość warstw podłoża i warstwy węgla, kierując się tym, że węgiel jest bardziej przezroczysty elektronicznie niż pallad.

Wirusy i przeciwciała przeciwko nim mają niską gęstość elektronową. Dlatego obiektów biologicznych nie można wykryć za pomocą mikroskopu elektronowego bez wstępnej obróbki. Aby uwidocznić wirusy, stosuje się technikę kontrastu ujemnego (lub barwienia negatywnego). Do ujemnego kontrastowania wirusów i kompleksów wirus-przeciwciało stosuje się różne sole metali ciężkich. Substancje kontrastujące (atomy metali ciężkich) wnikają w hydrofilowe obszary przedmiotów i zastępują w nich wodę. W efekcie wzrasta gęstość elektronowa obiektu, co umożliwia obserwację go w mikroskopie elektronowym.

Największe zastosowanie w praktyce znalazła bezpośrednia metoda IEM. Zawiesinę wirusa miesza się z nierozcieńczoną surowicą odpornościową. Po energicznym mieszaniu mieszaninę inkubuje się przez 1 godzinę w temp

37°C, następnie przez noc w 4°C. Następnego dnia mieszaninę odwirowuje się w celu wytrącenia kompleksów immunologicznych. Osad ponownie zawiesza się w kropli wody destylowanej i poddaje kontrastowi ujemnemu.

Oceniając wyniki IEM, produkty interakcji antygenu i przeciwciała w mikroskopie elektronowym mogą mieć różny wygląd (odrębna cząstka wirusa, całkowicie lub częściowo pokryta przeciwciałami; aglomeraty cząstek wirusa). Aglomeraty mogą zajmować różne obszary, mieć różny wygląd i zawierać różną liczbę cząstek. Dlatego obok eksperymentalnych konieczne jest badanie preparatów kontrolnych (z roztworem buforowym lub heterologiczną surowicą odpornościową).

Kryterium oceny wyników uzyskanych za pomocą IEM jest obecność lub brak w preparatach skupisk cząstek wirusa zagregowanych przez surowicę immunologiczną. Obecność aglomeratów antygenu i przeciwciał swoistej surowicy odpornościowej jest oznaką reakcji dodatniej. Należy jednak wziąć pod uwagę możliwość nieswoistej agregacji cząstek antygenu pod wpływem wirowania z dużą prędkością. Z tego powodu wielu autorów zaleca uwzględnienie wyników w skali warunkowej od 0 do 4+. Polega na ocenie stopnia pokrycia zagregowanych cząstek przeciwciałami surowicy.

Metody hemaglutynacji i hemadsorpcji. Wiele wirusów ma zdolność aglutynacji czerwonych krwinek ściśle określonych gatunków ssaków i ptaków. Zatem wirusy grypy i świnki aglutynują czerwone krwinki kurczaków, świnek morskich i ludzi; wirus kleszczowego zapalenia mózgu - erytrocyty owiec; Wirusy japońskiego zapalenia mózgu – czerwone krwinki jednodniowych piskląt i gęsi; adenowirusy - erytrocyty szczurów, myszy, małp. Jako materiał do badań w reakcji hemaglutynacji (HRA) wykorzystuje się płyny omoczniowe i owodniowe, zawiesiny błon kosmówkowo-omoczniowych zarodków kurzych, zawiesiny i ekstrakty z hodowli komórek lub narządów zwierząt zakażonych wirusami. Reakcję hemaglutynacji można przeprowadzić metodą kroplową na szkle oraz w rozłożonym rzędzie w probówkach lub studzienkach płytek styropianowych. Pierwsza metoda ma charakter orientacyjny.

Ponieważ RGA jest specyficzne dla grupy, nie umożliwia określenia gatunku wirusów. Identyfikuje się je za pomocą testu hamowania hemaglutynacji (HIT). Do jego produkcji wykorzystuje się znane, immunologiczne surowice przeciwwirusowe. Do każdego rozcieńczenia dodaje się taką samą ilość płynu zawierającego wirusa. Kontrolą jest zawiesina wirusa.

Mieszaninę trzyma się w termostacie, po czym dodaje się zawiesinę czerwonych krwinek. Po kilku minutach określa się miano surowicy neutralizującej wirusa, tj. jego maksymalne rozcieńczenie, co spowodowało opóźnienie aglutynacji erytrocytów.

W diagnostyce serologicznej chorób wirusowych zaleca się stosowanie RTGA z surowicami sparowanymi, z których jedną pobiera się na początku choroby, a drugą po 1-2 tygodniach lub dłużej. Czterokrotny wzrost miana przeciwciał w drugiej surowicy potwierdza wstępną diagnozę.

Reakcję hemadsorpcji (RGads) stosuje się do wykrycia w zakażonych hodowlach komórkowych wirusa wykazującego aktywność hemaglutynującą. Istota reakcji polega na tym, że czerwone krwinki wrażliwe na hemaglutynujące działanie wirusów adsorbują się na powierzchni komórek zakażonych wirusami. Na przykład erytrocyty kurczaka są adsorbowane na komórkach zakażonych wirusem ospy wietrznej; wirus odry - erytrocyty małp; adenowirusy - małpy i szczury itp.

Reakcja neutralizacji (PH). Podczas namnażania się w kulturach komórkowych wirusy powodują różne typy CPE, wyrażające się w zaokrąglaniu, marszczeniu, zmniejszaniu lub odwrotnie, zwiększaniu rozmiaru komórek, ich fuzji i tworzeniu symplastów, niszczeniu cytoplazmy i jądra. Wreszcie w monowarstwie komórek zakażonych wirusami, w wyniku zniszczenia przez nie poszczególnych odcinków warstwy komórkowej, mogą pojawić się „sterylne plamy”, czyli płytki będące klonem cząsteczki wirusa, co umożliwia nie tylko wyizolować wirusa, ale także określić jego miano.

Bardzo trudno jest zidentyfikować wirusa na podstawie natury łysinek, dlatego uciekają się do ustalania pH wyizolowanego wirusa za pomocą znanych surowic neutralizujących wirusa. W tym celu pobrany od pacjenta wirus akumuluje się w hodowli komórkowej, a jego różne rozcieńczenia miesza się z nierozcieńczoną surowicą przeciwwirusową.

Do zakażenia zarodków kurzych lub wrażliwych zwierząt można zastosować mieszaninę wirusów i surowic. W takich przypadkach działanie neutralizujące przeciwciał określa się najczęściej poprzez neutralizację hemaglutynin wirusowych w płynach embrionalnych i wyeliminowanie śmiertelnego działania wirusa na zarodki i zwierzęta. Jednocześnie oblicza się wskaźnik neutralizacji, wyrażający maksymalną liczbę dawek śmiertelnych wirusa neutralizowanego przez tę surowicę w porównaniu z wynikami doświadczenia kontrolnego, traktowanymi jako jeden.

Podobnie, stosując PH, identyfikuje się wirusy wyizolowane z materiału pacjenta, gdy zakażone są nimi zarodki kurze i zwierzęta. W tym celu do surowic neutralizujących wirusy dodaje się zawierające wirusy płyny embrionalne i zawiesiny dotkniętych narządów zwierząt. Po określonym czasie inkubacji mieszaniną zakaża się hodowle komórkowe, zarodki kurze i zwierzęta.

W serodiagnostyce infekcji wirusowych określa się dynamikę wzrostu miana przeciwciał neutralizujących wirusa dla znanego wirusa. W tym przypadku PH ustala się na podstawie sparowanych surowic pobranych od pacjentów na początku i na końcu choroby. Diagnostyczny będzie 4-krotny wzrost miana immunoglobulin w drugim z nich.

PH opiera się na zdolności specyficznych przeciwciał do wystarczająco silnego wiązania się z cząstką wirusa. W wyniku interakcji wirusa z przeciwciałem aktywność zakaźna wirusa zostaje zneutralizowana poprzez blokadę determinant antygenowych odpowiedzialnych za połączenie cząsteczki wirusa z wrażliwymi komórkami. W efekcie wirus traci zdolność do namnażania się w wrażliwym na niego układzie biologicznym in vitro lub in vivo.

Wyniki PH stają się widoczne po wprowadzeniu mieszaniny wirusa i przeciwciał homologicznych, po pewnym czasie ekspozycji, do wrażliwego układu biologicznego (komórki hodowli tkankowej, zarodek kurczaka, zwierzę podatne), gdzie wirus może się namnażać i powodować mierzalne zmiany, które będą ulega częściowej lub całkowitej supresji w obecności przeciwciał.

Na PH składają się trzy elementy:

• 1) wirus;
• 2) surowica zawierająca przeciwciała;
• 3) obiekt biologiczny (zwierzęta laboratoryjne, rozwijające się zarodki kurze, hodowle tkankowe), którego wybór zależy od rodzaju wirusa, z którym mają być prowadzone badania.

PH służy do identyfikacji izolowanego patogenu lub do wykrywania i oznaczania przeciwciał w surowicy. W pierwszym przypadku wykorzystuje się surowice specjalnie uodpornionych zwierząt laboratoryjnych lub osób ozdrowieńców. W drugim przypadku wykorzystuje się surowice pobrane w początkowej fazie choroby oraz w okresie rekonwalescencji.

Przeciwciała neutralizujące wirusa w surowicy wyzdrowiałych osób, w przeciwieństwie do przeciwciał antyhemaglutyninowych czy przeciwciał wiążących dopełniacz, utrzymują się przez wiele lat, a w przypadku niektórych infekcji wirusowych (np. odry) nawet przez całe życie. Pozwala to w niektórych przypadkach na wykorzystanie jako leku referencyjnego puli surowic wielu rekonwalescentów, która po napełnieniu ampułek i liofilizacji przez długi czas nadaje się do pracy diagnostycznej.

Do identyfikacji izolowanych patogenów stosuje się wstępnie przygotowane surowice hiperimmunizacyjne różnych zwierząt: królików, białych szczurów i myszy, świnek morskich, małp, owiec, koni itp. Aktywność surowic hiperimmunologicznych na PH zależy od metody immunizacji zwierząt.

Przed wykonaniem każdego doświadczenia neutralizacji wirus jest wstępnie miareczkowany w celu określenia końcowego rozcieńczenia, które powoduje uszkodzenie hodowli tkankowej lub zakażenie zwierząt laboratoryjnych (lub zarodków kurzych). Miano wirusa wyrażono jako dawkę 50% (TCID50 – 50% dawka zakaźna dla hodowli tkankowej).

Molekularne metody diagnostyki genetycznej w praktyce wirusologicznej. Metody biologii molekularnej zostały opracowane już w latach 50. XX wieku. XX wiek. Stało się to możliwe dzięki temu, że genom każdego wirusa zawiera unikalne, specyficzne dla gatunku sekwencje nukleotydów, które można wykryć w celu zidentyfikowania dowolnego czynnika zakaźnego. Metody te mają największe znaczenie w identyfikacji mikroorganizmów, które są czasochłonne lub trudne w hodowli metodami konwencjonalnymi. W latach 70. XX wieku do identyfikacji zakaźnego patogenu lub mutacji stosowano wykrywanie sond DNA, oparte na hybrydyzacji specyficznych sond oligonukleotydowych znakowanych radioaktywnym izotopem (lub fluorochromem) z izolowaną próbką DNA. Analiza hybrydyzacji wykorzystuje zdolność kwasów nukleinowych do tworzenia w pewnych warunkach specyficznych kompleksów z kwasami nukleinowymi, które mają sekwencje komplementarne do nich. Metoda wykrywania patogenów zakaźnych metodą hybrydyzacji DNA okazała się niezwykle pracochłonna, czasochłonna i kosztowna. Ponadto jego czułość jest niewystarczająca do identyfikacji mikroorganizmów w materiałach klinicznych, takich jak kał i mocz.

Hybrydyzacja DNA została zastąpiona metodą imitującą naturalną replikację DNA i pozwalającą na wykrycie i wielokrotne skopiowanie określonego fragmentu DNA za pomocą termofilnej polimerazy DNA. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to elegancka metoda naśladująca naturalną replikację DNA i umożliwiająca wykrycie określonego fragmentu DNA i jego wielokrotne kopiowanie przez termofilną polimerazę DNA.

PCR ze względu na swoje wysokie walory diagnostyczne jest powszechnie uznanym dodatkiem do tradycyjnych metod stosowanych w wirusologii: namnażania wirusa w hodowli komórkowej, immunologicznej detekcji antygenów wirusowych, mikroskopii elektronowej. Istotną zaletą tej metody jest możliwość wykrywania wirusów w zakażeniach utajonych (cytomegalowirus, wirus opryszczki) oraz wirusów trudnych lub niemożliwych do hodowania (wirus ludzkiego niedoboru odporności, wirus Epsteina-Barra, wirus brodawczaka ludzkiego, wirus zapalenia wątroby Widr.). Metoda PCR wiąże się z perspektywami badania chorób takich jak choroba Creutzfeldta-Jakoba, choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane.

Rozpoznanie ACI ustala się na podstawie danych klinicznych i epidemiologicznych, z obowiązkowym potwierdzeniem laboratoryjnym. Bez potwierdzenia laboratoryjnego rozpoznanie ACI można postawić tylko w przypadkach, gdy istnieją jasno ustalone dane epidemiologiczne (w ogniskach zakażenia oraz w laboratoryjnie rozszyfrowanych ogniskach grupowych chorób u większości pacjentów).

Do ostatecznej diagnozy stosuje się metody badań bakteriologicznych, wirusologicznych i serologicznych, metoda skatologiczna, a także wyniki sigmoidoskopii (w kierunku shigellozy) mają wartość pomocniczą.

I. Metoda bakteriologiczna ma największe znaczenie w ostrych infekcjach jelit wywołanych florą bakteryjną (biegunka inwazyjna i wydzielnicza). Najlepsze efekty daje wysiew kału bezpośrednio przy łóżku pacjenta, przed przepisaniem terapii przeciwbakteryjnej i dostarczenie go do laboratorium bakteriologicznego w ciągu pierwszych dwóch godzin od momentu pobrania. Do badań konieczne jest wybranie cząstek zawierających patologiczne zanieczyszczenia, ale nie krew. Biomateriał inokuluje się na selektywnych pożywkach Ploskireva, Levina itp. Negatywny wynik badania bakteriologicznego kału podaje się w 3-5 dniu, a pozytywny z reguły w 5-7 dniu od momentu Materiał dostarczany jest do laboratorium bakteriologicznego. Częstotliwość wyników pozytywnych (hodowla patogenu i jego identyfikacja), nawet w przypadku typowych objawów klinicznych ostrych infekcji jelitowych. Nie przekracza 70-80%.

II. Metody serologiczne diagnostykę stosuje się z reguły w przypadkach wątpliwych i przy ujemnych wynikach badania bakteriologicznego kału. U dzieci w pierwszym miesiącu. W życiu nie jest to zbyt pouczające, ale we wszystkich przypadkach ważny jest wzrost miana przeciwciał 4-krotnie lub więcej. Przeprowadza się je w dwóch kierunkach – oznaczając miano swoistych przeciwciał w surowicy krwi pacjenta i antygenu w kale.

Do określenia miana swoistych przeciwciał najczęściej stosuje się RNGA, rzadziej RPGA lub RA. Za antygeny przyjmuje się zawiesinę codziennej hodowli bakterii (RZS) lub diagnostykę erytrocytów. ( RPGA, RNGA). Za bardziej wiarygodny należy uznać wzrost miana przeciwciał w trakcie choroby. Specyficzne przeciwciała we krwi pacjenta z ostrą infekcją jelitową pojawiają się w 3-5 dniu choroby i wzrastają do maksimum w ciągu 2-3 tygodni, a następnie stopniowo maleją. U małych dzieci, szczególnie ze zmienionym podłożem przedchorobowym, swoiste przeciwciała nie są wykrywane we krwi lub mają niskie miano (1:50 – 1:100).

W przypadku wystąpienia typowych objawów klinicznych i wykrycia diagnostycznego miana swoistych przeciwciał (1:200 i wyższe przy odpowiedniej diagnostyce) lub wzrostu ich miana w dynamice choroby, należy postawić rozpoznanie kliniczne infekcji jelitowej. uważa się za ustalone nawet w przypadku braku wysiania patogenu z kału pacjenta.

III. Ekspresowe metody diagnostyczne Infekcje jelitowe opierają się na wykryciu antygenu patogenu (bakterii lub wirusa) w kale, przy czym wykorzystuje się metodę bezpośrednią z wykorzystaniem przeciwciał luminescencyjnych (DMLA) lub metodę immunoadsorpcyjną – reakcję aglomeracji węgla (CAR). Wstępny wynik można uzyskać w ciągu 2-3 godzin, ostateczny wynik w ciągu jednego dnia. Swoistość metody wynosi 82-94,6%.

W ostatnich latach do szybkiej diagnostyki biegunki zaczęto stosować test immunoenzymatyczny (ELISA) i test aglutynacji lateksowej (LAR).

Rozszyfrowanie etiologiczne biegunki wirusowej odbywa się za pomocą metod wirusologicznych i bakteriologicznych.

Za optymalny okres wykrywania wirusów w kale uważa się okres od 1. do 4. dnia choroby, chociaż patogen często utrzymuje się dłużej.

Główną stosowaną metodą jest mikroskopia elektronowa, która umożliwia identyfikację szerokiego zakresu czynników wirusowych wywołujących zapalenie żołądka i jelit na podstawie cech morfologicznych.

Wykorzystuje się także mikroskopię immunoelektronową (bazującą na zdolności cząsteczek wirusa w obecności surowic homologicznych lub surowic rekonwalescencyjnych do tworzenia agregatów cząstek rotawirusa z immunoglobulinami).

Do tradycyjnych metod serodiagnostyki zalicza się reakcję neutralizacji, hamowanie hemaglutynacji i wiązanie dopełniacza.Dwu- do czterokrotny wzrost poziomu przeciwciał w sparowanych surowicach ma retrospektywne znaczenie w diagnostyce zakażenia rotawirusem. Do wykrycia rotawirusów lub ich antygenów stosuje się metodę ELISA, wytrącanie rozproszone, aglutynację lateksową i reakcję koaglutynacji.

W praktyce najbardziej rozpowszechnione miejsce zajęła metoda ELISA – izolacja antygenów rotawirusów w koprofiltrach. Lepiej stosować te metody w miarę upływu czasu (w pierwszym dniu hospitalizacji i po wyzdrowieniu klinicznym).

W celu wykluczenia bakteryjnej etiologii ostrych infekcji jelitowych badanie bakteriologiczne kału przeprowadza się poprzez zaszczepienie go na pożywce

Sigmoidoskopia Metoda ta jest rzadko stosowana u dzieci, głównie w celu ustalenia przyczyny przedłużonego wydalania bakterii oraz diagnostyki przewlekłych i przewlekłych postaci choroby. Ta metoda badania pozwala jedynie na ocenę charakteru zmian morfologicznych w błonach śluzowych dystalnej części jelita, nie pozwala jednak na postawienie diagnozy etiologicznej infekcji jelitowej.

Wskazaniami do badania instrumentalnego (USG, RTG narządów jamy brzusznej, FGS) w przypadku ostrych infekcji jelitowych jest konieczność diagnostyki różnicowej z chorobami chirurgicznymi narządów jamy brzusznej (wgłobienie, zapalenie wyrostka robaczkowego), chorobami somatycznymi (nieżyt żołądka, wrzód trawienny, zapalenie pęcherzyka żółciowego i trzustki itp.) oraz zaburzenia czynnościowe przewodu żołądkowo-jelitowego.

Określenie postaci klinicznej zatrucia (neurotoksykoza, zatrucie z egzokozą, ITS), jej stopnia (stadium), rodzaju odwodnienia w biegunce zakaźnej u dzieci oraz zapewnienie opieki doraźnej