Hüceyrə mədəniyyətləri

Heyvanlar

Aşağıdakı hadisələrə əsaslanan virusların göstəricisi

İnkişaf ləngiməsi

ölüm, dəyişiklik

embrionun membranları, RGA

CPP, lövhə əmələ gəlməsi, RIF, RGads, müdaxilə

Xəstəlik, ölüm,

histoloji dəyişikliklər

toxumalarda, daxilolmalarda

Təcrid olunmuş virusun titrlənməsi; iş dozasının seçimi.

Virus titri- gözlənilən təsirin hələ də müşahidə olunduğu virus tərkibli materialın maksimum seyreltilməsi (CPE, RGA, heyvanın ölümü).

İzolyasiya edilmiş virusun identifikasiyası diaqnostik sera ilə neytrallaşdırma reaksiyalarında, RTGads, RSC, lövhə əmələ gəlməsinin yatırılması və s. Virusun növü (növü). virusun spesifik təsirini müvafiq immun serumla neytrallaşdırmaqla müəyyən edilir.

Qeyd: Titrləmə və virusun identifikasiyası eyni fenomendən istifadə etməklə həyata keçirilir.

Virus yetişdirilməsi

Virus xəstəliklərinin diaqnostikasında istifadə olunan əsas üsullar virusların becərilməsi və identifikasiyasıdır.

Xəstəliyin viral etiologiyasını sübut etmək üçün aşağıdakılar lazımdır: virusun xəstə balığın bədənindən təcrid edilməsi, onun hüceyrə kulturasına və ya həssas balıqlara keçməsi, xəstəliyin eyni və ya əlaqəli sağlam balıqlarda çoxalması. növlər, eyni virusun eksperimental heyvanlardan təkrar təcrid edilməsi.

Virusları müəyyən etmək üçün bir neçə tamamlayıcı üsuldan istifadə olunur: virusun elektron mikroskopiyası, onun fiziki-kimyəvi xüsusiyyətlərinin öyrənilməsi, yoluxmuş hüceyrələrdə xarakterik morfoloji dəyişikliklərin və yoluxmuş heyvanlarda simptomların aşkarlanması, müxtəlif immunoloji üsullar.

Viruslar əsasən bir qatlı ilkin və ya davamlı hüceyrə kulturalarında təcrid olunur, hər bir halda müəyyən bir virusa həssas olan mədəniyyətlər seçilir. Balıq hüceyrələrinin ilkin kulturalarını əldə etmək üçün ən çox dişi sazan və ya crucian sazan cinsiyyət orqanları istifadə olunur. Gonadlar Kiseleviç şkalası üzrə yetkinliyin II və ya II-III mərhələsi olmalıdır. Belə cinsi vəzilərdə adi gözlə görünən yumurtalar yoxdur. Əks təqdirdə, yumurtaların məzmunu hüceyrə böyüməsinə mənfi təsir göstərəcəkdir. Sazan və crucian balığının cinsi vəzilərindən hüceyrə kulturaları təsdiq edilmiş üsulla hazırlanır.

Davamlı kulturalar kimi aşağıdakı hüceyrə xətləri ən çox istifadə olunur: FHM - piybaşı minnowunun kaudal peduncle toxumalarından; RTG - göy qurşağı alabalıq cinsiyyət orqanlarından; EPC - sazan dərisindəki çiçək xəstəliyindən. Bu xətlər baytarlıq və balıqçılıq elmi-tədqiqat institutlarında balıq xəstəliklərinin tədqiqi üçün xüsusi laboratoriyalarda saxlanılır, sifariş və qəbul oluna bilər.

Yaxşı öyrənilmiş viral xəstəliklər diaqnozu qoyulduqda, patogenin cəmləşdiyi orqan və toxumalar araşdırılır.

Haqqında məlumatı yetərli olmayan balıq xəstəlikləri zamanı daha çox təsirlənən orqanlar virusoloji müayinədən keçirilir. Dəridən və qəlpələrdən qırıntılar, bu orqanların parçaları seliklə birlikdə 2-3 ml steril fizioloji və ya tampon məhlulu olan steril flakonlara yerləşdirilir. Daxili orqanlardan nümunələr ciddi aseptik şəraitdə götürülür.

Materialı tez yoxlamaq mümkün olmadığı hallarda, soyuducuda 5 ° C-dən çox olmayan bir temperaturda bir gündən çox olmayaraq saxlanılır. Dondurulmuş material daha uzun müddət saxlanıla bilər.

Tədqiqat üçün nəzərdə tutulmuş patoloji material homogenizatorda əzilir və ya kvars qumu ilə çini harçında üyüdülür. Hanks, Earle, tampon və ya şoran məhlullarında əzilmiş toxumalardan 10%-lik süspansiyon hazırlanır və 2000-3000 rpm-də 10-15 dəqiqə sentrifuqa edilir, supernatant pipetlə sorulur və steril flakonlara yerləşdirilir. Əgər suspenziya steril deyilsə, hazırlanmış materiallar məsamə diametri 0,2-0,45 mkm olan membran filtrlərdən süzülür və ya antibiotiklərlə (penisilin 1000 U/ml və streptomisin 1000 mkq/ml) müalicə olunur.

Bağırsaq tərkibindən steril distillə edilmiş suda 20% suspenziya hazırlanır və 2000 rpm-də 10-15 dəqiqə sentrifuqalanır. Supernatant yenidən 4000-5000 rpm-də 30 dəqiqə sentrifuqalanır. Sonra supernatant steril flakona aspire edilir və antibiotiklərlə müalicə olunur. 1 ml-ə 1000 μg/ml streptomisin və 1000 U/ml penisilin əlavə edin. Qarışıq 2-3 saat otaq temperaturunda saxlanılır. Bütün materiallar MPB və MPA ilə inokulyasiya yolu ilə bakterial sterillik üçün sınaqdan keçirilir. Hazırlanmış materiallar dərhal iş üçün istifadə olunur və ya həddindən artıq hallarda, dondurulmuş (mənfi 20 ° C temperaturda) saxlanılır.

Hüceyrə mədəniyyətinin infeksiyası. İnfeksiya üçün eksplant ətrafında yaxşı hüceyrə monolayı və ya böyümə zonası olan borular istifadə olunur. Qida mühiti sorulur və hər sınaq borusuna 0,2-0,3 ml sınaq süspansiyonu əlavə edilir. Eyni zamanda sınaq borularına 0,8-0,9 ml 2-3% zərdablı qidalı mühit əlavə edilir.

Hər bir nümunədən hazırlanan material 4-6 sınaq borusunda toxuma mədəniyyətini yoluxdurmaq üçün istifadə olunur. Tədqiqatların hər seriyasından, onlara 1 ml qidalı mühit əlavə edilməklə, eyni sayda sınaq boruları nəzarət olaraq qalır. Virusun hüceyrələrə adsorbsiya edilməsi üçün borular otaq temperaturunda 1-2 saat saxlanılır, sonra supernatant pipetka ilə sorulur və qidalandırıcı qida mühiti ilkin həcmə əlavə edilir.

Yoluxmuş və nəzarət hüceyrə kulturaları 22-26°C temperaturda inkubasiya edilir və hüceyrələrdə morfoloji dəyişiklikləri aşkar etmək üçün hər gün aşağı böyüdücü mikroskop altında yoxlanılır. Şiddətli hüceyrə degenerasiyası zamanı mədəni maye sorulur və keçidlər edilir, sitopatogen təsir (CPE) olmadıqda isə iki ardıcıl keçid aparılır. Bunun üçün təkrar dondurma və ərimə nəticəsində məhv edilmiş hüceyrə fraksiyaları ilə birlikdə mədəni maye istifadə olunur. Təzə mədəniyyətləri yoluxdurmaq üçün sentrifuqalanmış hüceyrə kütləsinin supernatantından istifadə edin. Üçüncü keçiddən sonra CPE viral agentin spesifik təsiri kimi nəzərə alınır.

Hüceyrənin monolayerinin zədələnmə dərəcəsi 4 çarpaz sistemdən istifadə etməklə qiymətləndirilir; " + - 25% -ə qədər zərər, " + + " - 50% -ə qədər, "+ + +" - 75% -ə qədər və " + + + + " - monolayerin 100% -ə qədər.

Balıqların bəzi virus xəstəliklərində müxtəlif orqan və toxumaların hüceyrələrində (sitoplazmik nüvədə) daxilolma cisimləri görünür. Viral daxilolmaların tədqiqi üçün material yoluxmuş toxuma mədəniyyətləri, orqan və toxumalardan qırıntılar və təəssürat ləkələridir, bu materiallar Dubosc-Brazil-Buena, Buena, Carnoy mayeləri və ya 10% məhluldan istifadə edərək, ümumi qəbul edilmiş üsullara uyğun olaraq sabitlənir; neytral formaldehid.

Viral daxilolmalar müxtəlif üsullarla boyanır: Muromtsev, Rubina, Mann, Sellex, Klisenko, Romanovsky-Giemsa, May-Grunald-Giemsa və s.

Virus titrasiyası- viral aktivliyin kəmiyyət təyini. Virus titri virus suspenziyasının vahid həcminə düşən yoluxucu vahidlərin sayı ilə ifadə edilir. Virusun yoluxucu vahidi ona yoluxmuş həssas obyektlərin 50%-də infeksiyaya səbəb olan doza kimi müəyyən edilir. Virusun bu dozası yoluxucu adlanır və ID 50 olaraq təyin olunur.

Hüceyrə kulturalarından balıq viruslarının titrlənməsi zamanı əsasən həssas obyektlər kimi istifadə olunur. Hüceyrə kulturası üzərində titrləmə virusların sitopatogen təsirinə uyğun olaraq aparılır. Bu halda, ID 50 toxuma sitopatogen dozası (TCD 50) adlanır və virus titri 1 ml viral suspenziyada TCD 50 miqdarı ilə ifadə edilir. Virus titri son seyreltmə üsulu ilə müəyyən edilir. Bu üsula əsasən, həssas hüceyrə kulturaları ardıcıl olaraq artan seyreltmələrdə müəyyən həcmdə virus suspenziyasını yeridirlər və hər bir inyeksiyanın nəticəsinin müsbət (CPP varsa) və ya CPP olmadıqda mənfi olması nəzərə alınmaqla, titrləmə son nöqtə hesablanır - 1 TCD 50.

Aydın bir CPE verən virusları titr etmək üçün lövhə üsulu da istifadə olunur. Bu vəziyyətdə, virusun ilkin yoluxmuş hüceyrələrdən əhəmiyyətli dərəcədə çıxarılan digər hüceyrələrə keçməsinin qarşısını almaq və ilkin yoluxdura bilməsi üçün virusa yoluxmuş hüceyrələrin bir təbəqəsi, qida mühitinin agar ilə qarışığı ilə tökülür. lövhənin infeksiya ocaqları).

Hər bir lövhə PFU (lövhə əmələ gətirən vahid) təyin olunan tək bir yoluxucu vahiddən yaranır və virusun titri süspansiyonun vahid həcminə görə PFU sayı kimi ifadə edilir.

Neytrallaşma reaksiyası(RN) hüceyrə mədəniyyəti haqqında.

Reaksiya antigenin homoloji antiserumun antikorları ilə bağlanmasına əsaslanır. Reaksiya viral etiologiyalı xəstəliklərin diaqnozunda patogenləri müəyyən etmək üçün istifadə olunur. O, məlum antikorlar və ya məlum (standart) antigen - xəstə və ya sağalmış balıqların zərdabında naməlum antikorlar vasitəsilə naməlum virus antigeni təyin etməyə imkan verir.

Zərərsizləşdirmə reaksiyasında təcrid olunmuş virusun təyini onlara homolog olan antigenlərin (virusların) diaqnostik hiperimmun antiserumlarının (antikorlarının) dəsti ilə həyata keçirilir.

Hiperimmün antiserumlar laboratoriya heyvanlarını (məsələn, dovşanları) balıq xəstəliklərinə səbəb olan virusların məlum ştammları ilə yoluxdurmaqla əldə edilir. Alınan antiserumlarda spesifik anticisimlərin titrləri müəyyən edilir. İş üçün yüksək titrlərdə antikorları olan antiserumlar qəbul edin.

Reaksiya qaydası.

1. Normal və hiperimmun zərdabın 56 o C-də 30 dəqiqə qızdırmaqla inaktivasiyası.

2. Reaksiya tərkib hissələrinin seyreltmələrinin hazırlanması. Antigen və serum 1: 5, 1: 50, 1: 500-dən başlayaraq və 1 TCD 50 / 0,2 ml-dən az olan seyreltmə əldə olunana qədər serum və antibiotiksiz qida mühiti ilə seyreltilir. Hiperimmun zərdab 1:2 və ya 1:5 nisbətində seyreltilir. Normal zərdab hiperimmun serum kimi seyreltilir.

3. Reaksiyanın qurulması. Üç sıra steril borular rafa qoyulur. Birinci sıraya seyreltilmiş hiperimmun zərdab, ikinci sıraya seyreltilmiş normal zərdab, üçüncü sıraya qidalı mühit tökülür. Hər bir tərkib hissəsi 0,5 ml həcmdə əlavə olunur.

Virusun hazırlanmış seyreltmələri 0,5 ml miqdarda üç sıranın hər birinin müvafiq sınaq borularına köçürülür və hər bir seyreltmənin I virusu ən yüksək seyreltmədən başlayaraq ayrıca pipetka ilə köçürülür. Beləliklə, sınaq borularının hər bir cərgəsində virusun ardıcıl 10 qat qatılaşdırılması əldə edilir: 10-1, 10-2 və s.

Serumların toksikliyinə nəzarət etmək üçün ayrıca sınaq borusuna 0,5 ml hiperimmun zərdabın hazırlanmış seyreltməsi əlavə edin və sonra bərabər miqdarda qida mühiti əlavə edin. Eyni şey adi serum ilə edilir.

Qarışıqları olan sınaq boruları yaxşıca çalxalanır və otaq temperaturunda 1 saat saxlanılır. Sonra hüceyrə kulturası virusun hər bir seyreltilməsi ilə (hər boru üçün 0,2 ml) hiperimmun normal serum və qida mühiti, hər birində 4 hüceyrə kulturası ilə yoluxur. Eyni zamanda, istifadə olunan hüceyrələrin toksikliyi və nəzarət hüceyrə mədəniyyəti nümunələri üçün nəzarətlər yerləşdirilir.

Hüceyrə kulturası olan borular müəyyən bir virusun yayılması üçün optimal temperaturda termostatda inkubasiya edilir və virusun CPE-ni aşkar etmək üçün hər gün aşağı böyüdücü mikroskop altında yoxlanılır. Nəticələr cədvələ daxil edilir (Cədvəl 11).

Virus titri virus suspenziyasının vahid həcminə düşən yoluxucu vahidlərin sayı ilə ifadə edilir. Neytrallaşdırma indeksini (IN) tapın. Hiperimmün serum tərəfindən zərərsizləşdirilə bilən maksimum ID 50 miqdarına uyğundur. IN düsturu ilə hesablanır: logIN = logT 1 -lgT 2, burada T 1 normal serumun mövcudluğunda virusun titridir; T 2 - hiperimmun serumun mövcudluğunda virus titri. IN dəyəri antiloqarifmlər cədvəlindən tapılır. Ümumiyyətlə qəbul edilir ki, 10-a qədər olan IN dəyəri mənfi, 10-dan 49-a qədər şübhəlidir və 50 və ya daha çox müsbət nəticədir.

Reaksiya nəticələri yalnız hiperimmun zərdab xüsusi neytrallaşdırıcı fəaliyyət üçün sınaqdan keçirildikdə etibarlı hesab edilə bilər. Bunun üçün əvvəlcə bu zərdabda neytrallaşdırıcı anticisimlərin titri və ya onun homoloji virusla reaksiyada neytrallaşma indeksi müəyyən edilir.

Lövhə üsulu ilə rabdovirusların izolyasiyası. Bu üsul spesifikdir, virusun identifikasiyası üçün spesifik immun zərdablar olduqda sazan və alabalığın rabdoviruslarının ayrılması, ilkin tipləşdirilməsi və seçilməsi üçün istifadə olunur.

Dəyirmi koloniyalar (lövhələr) test materialında virusun iştirakı ilə bir agar örtüyü altında hüceyrə mədəniyyətlərində formalaşır.

Aseptik şəraitdə böyrək, qaraciyər, dalaq toxuması və qarın boşluğundan maye Pasteur pipeti ilə toplanır, 1:10 nisbətində 500 IU (mkq)/ml antibiotik olan mühit olan şüşəyə köçürülür. 18-22 °C temperaturda 60-90 dəqiqə inkubasiya edilir, sonra 2-3 min rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edilir. Supernatant qida mühiti ilə 1:10 (seyreltmə 1:100) ilə seyreltilir. Hüceyrə mədəniyyətlərini yoluxdurmaq üçün hər iki seyreltmənin supernatant mayeləri istifadə olunur.

Tədqiqat üçün, patoloji materialın hər seyreltilməsi üçün 2 döşək və nəzarət üçün 2 döşək nisbətində yaxşı müəyyən edilmiş bir təbəqə ilə döşəklərdə yetişdirilən 3 günlük davamlı hüceyrə mədəniyyəti seçilir. Qidalı mühit şüşələrdən çıxarılır və fetal serumu olmayan 2 ml mühit əlavə edilir. Sonra 0,2 ml sınaq materialı əlavə edilir və balıqları yoluxduran viruslar üçün optimal temperaturda (sazan virusları üçün - 24-26°C və alabalıq virusları üçün - 16-18°C) 60 dəqiqə ərzində virusu adsorbsiya etmək üçün buraxılır.

Nəzarət 100 TCD 50/ml məlum virus olan hər biri 0,2 ml hüceyrə kulturaları olan 2 döşəkdə və virussuz 2 - 0,2 ml qidalı mühitdə yerləşdirilir.

60 dəqiqədən sonra maye şüşələrdən çıxarılır. Bir təbəqənin qarşısındakı divar boyunca, 40-42 ° C-yə qədər qızdırılan 5 ml agar örtüyü 50 ml şüşəyə əlavə olunur, 40-42 ° C-yə qədər qızdırılır (HCV virusunu təcrid edərkən - 38 ° C-dən çox olmayan). Döşəklər bir qat aşağı çevrilir və qara kağızla örtülür. 15-20 dəqiqədən sonra döşəklər tədqiq olunan viruslar üçün optimal temperaturda inkubasiya üçün köçürülür. Döşəklər agar örtüyü yuxarıya baxacaq şəkildə yerləşdirilir. Virus məlum deyilsə, kulturalar iki temperatur şəraitində - 14-18 və 22-24°C-də saxlanılır.

Yoluxmuş hüceyrə mədəniyyətlərinə ağ fonda baxılır. Əgər tədqiq olunan hüceyrə kulturasında virus varsa, kulturanın çəhrayı-tutqun fonunda əvvəlcə şəffaf nöqtələr görünür. Sonradan onlar ölçüsü artır, yuvarlaq şəffaf koloniyalar - lövhələr əmələ gətirirlər, onların olması patoloji materialda rabdovirusların olduğunu göstərir.

Pasteur pipetindən istifadə edərək, təsirlənmiş və təsirlənməmiş hissələrin sərhəddindəki lövhədən elə bir parça götürün ki, təkcə agar təbəqəsi deyil, həm də hüceyrə təbəqəsi daxil olsun. Seçilmiş parça 1 ml böyümə mühiti olan sınaq borusuna yerləşdirilir, mənfi 20 ° C-də dondurulur və 60 dəqiqə saxlanılır. Çox sayda lövhə olduqda (bütün hüceyrə təbəqəsi şəffafdır), tədqiqatlar 10 -3 və 10 -4 seyreltmələrdə təkrarlanır.

24-26°C temperaturda inkubasiya edilmiş EPC və FHM-nin davamlı kulturasında 3-8 mm diametrli sazan rabdovirusunun lövhələri 4-7-ci gündə görünür.

Lövhələrin olmadığı və hüceyrə mədəniyyətlərində CPD-nin olması halında, 10 -2 -10 -3 (2-3 keçid) seyreltmələrində virus tərkibli mədəniyyət mayesi üzərində əlavə tədqiqatlar aparılır. Virusları müəyyən etmək üçün əlavə üsullara aşağıdakılar daxildir: flüoresan antikor metodu; virusun xloroforma, efirə, pH dəyərinə, qızdırmaya həssaslığının təyini; virusların morfologiyasının elektron mikroskopik tədqiqi.

Kurs işi

“Klinik virusologiyanın üsulları”

Giriş

Viral infeksiyaların laborator diaqnostikası əsasən elektron mikroskopiya, həssas hüceyrə kulturaları və immunoloji üsullardan istifadə etməklə aparılır. Bir qayda olaraq, viral infeksiyanın mərhələsindən asılı olaraq diaqnoz qoymaq üçün bir üsul seçilir. Məsələn, hər üç yanaşma suçiçəyi diaqnostikasında faydalı ola bilər, lakin mikroskopiya və hüceyrə kulturası üsullarından uğurlu istifadə xəstəliyin nisbətən erkən mərhələsində qənaətbəxş nümunələr toplamaq qabiliyyətindən asılıdır.

Böyük dərəcədə viral diaqnostikanın müvəffəqiyyəti alınan nümunələrin keyfiyyətindən asılıdır. Bu səbəbdən lazımi nümunələrin toplanmasında laboratoriya əməkdaşlarının özləri bilavasitə iştirak etməlidirlər. Nümunələrin xüsusiyyətləri, eləcə də onların laboratoriyaya çatdırılması üsulları Lennett, Schmidt, Christ, et al.

Laboratoriya diaqnostikasında istifadə olunan reagentlərin və alətlərin əksəriyyətini müxtəlif şirkətlərdən almaq olar. Əksər hallarda eyni reagent bir neçə şirkət tərəfindən eyni vaxtda istehsal olunur. Bu səbəbdən, reagent yalnız bir şirkət tərəfindən təmin edilmədikdə, ayrı-ayrı şirkətləri göstərməmişik. Bütün digər hallarda, cədvəldə göstərilən təchizatçıların ümumi siyahısına müraciət etməlisiniz. 1.

İnsanların viral infeksiyalarının diaqnostikası üçün hazırda mövcud olan bütün metodların hərtərəfli təsvirini təqdim etməyi məqsəd qoymadıq. Əvvəlcə əsas üsulları təsvir etdik. Müstəqil işləmək təcrübəsi qazandıqca, bu əsas üsullar daha mürəkkəb problemləri həll etmək üçün istifadə edilə bilər.

1. Elektron mikroskopiyası

Viral infeksiyaların elektron mikroskopik diaqnostikası üçün təsirlənmiş toxumanın nazik hissələrindən istifadə edilə bilər. Elektron mikroskopiya üçün ən çox istifadə edilən material nəcis və ya mayedir.

Cədvəl 1. Reagent və avadanlıq tədarük edən şirkətlərin siyahısı

suçiçəyi kimi bəzi xəstəlikləri xarakterizə edən veziküllər. Belə materialı təhlil edərkən, virusları mənfi boyanmadan istifadə edərək aşkar etmək olar ki, bu da elektron sıx materialın virion komponentlərini təsvir etməsi ilə nəticələnir. Metod, test nümunələrində, məsələn, nəcisdə və ya vezikulyar mayedə virusun konsentrasiyası yüksək olduqda effektivdir. Nümunələrdəki viral hissəciklərin tərkibinin az olduğu hallarda, virusun aşkarlanması ehtimalı virusun ultrasentrifuqa ilə konsentrasiyası və ya onu xüsusi antikorlarla birləşdirərək artırıla bilər. Sonuncu üsul virusları müəyyən etmək üçün də əlverişlidir. Burada biz rotavirus infeksiyasının diaqnostikasının elektron mikroskopik metodunu və parvoviruslara qarşı spesifik antikorların aşkarlanması nümunəsindən istifadə edərək immunoelektron mikroskopiya metodunu təsvir edəcəyik. Elektron mikroskopiya üsulları Field tərəfindən daha ətraflı təsvir edilmişdir.

2.1 Nəcisin birbaşa elektron mikroskopik müayinəsi

1. Pasteur pipetinin ucunu nəcisə batırın və 1 sm yaxma əldə etmək üçün kifayət qədər material çəkin.

2. Şəffaf suspenziya əldə olunana qədər nəcis yaxmasını elektron mikroskopik mənfi kontrastlı ləkədə yenidən dayandırın. Mənfi kontrastlı boya, distillə edilmiş suda fosfotunqstik turşunun 2% həllidir.

3. Elektron mikroskopik nümunəni əldə etmək üçün süspansiyonun bir damcısı karbon-formvar plyonka ilə örtülmüş elektron mikroskop toruna yerləşdirilir. Bu əməliyyat zamanı mesh bir cüt nazik cımbızla tutulur.

4. Dərman 30 s havada qalır.

5. Süzgəcin kənarına filtr kağızı ilə toxunmaqla artıq maye çıxarılır.

6. Dərman havada qurudulur.

7. Zəruri hallarda 440 000 μW-s/sm2 intensivliyi olan ultrabənövşəyi şüa ilə şəbəkənin hər iki tərəfini şüalandırmaq yolu ilə canlı virus təsirsiz hala gətirilir. Bu vəziyyətdə filtrli qısa dalğalı ultrabənövşəyi lampa istifadə olunur. Lampa şəbəkədən 15 sm məsafədə olmalıdır; Hər tərəf üçün şüalanma müddəti 5 dəqiqədir.

8. Rotavirus virionları 30.000-dən 50.000-ə qədər böyüdülmə ilə ötürülən elektron mikroskop altında xarakterizə edilə bilər.

2.2 İmmunelektron mikroskopiya

Aşağıda təsvir edilən immunoelektron mikroskopiya üsulu bir çox oxşar immunoloji üsullardan yalnız biridir. Virus spesifik antikorları öyrənmək üçün, əlavə olaraq, A proteininin mikroskopik şəbəkəsinə bağlanmağı nəzərdə tutan bir üsul istifadə olunur. Antiviral antikorların iş konsentrasiyası 1/10-dan 1/1000-ə qədər olan sınaq və səhv yolu ilə müəyyən edilir. Göstərdiyimiz konsentrasiya adətən gündəlik işlərdə istifadə olunur. Antikorların virusla qarşılıqlı əlaqəsi üçün optimal nəticələr əldə etmək üçün tərkibində parvovirus olan zərdab eyni şəkildə titrlənir.

1. İnsan parvovirusuna qarşı 10 µl antiserum PBS ilə 100 dəfə seyreltilir. Həll su banyosunda 56 ° C-ə qədər qızdırılır.

2. PBS-də 10 ml 2% agarozu adi qaydada əridin və su hamamında 56 °C-ə qədər soyudun.

3. 56 °C-də 1 ml seyreltilmiş antiserumu 1 ml 2% agaroza ilə qarışdırın.

4. Nəticədə qarışığın 200 µl-ni 96 çuxurlu mikrotitr plitəsinin iki quyusuna köçürün.

5. Agarozun otaq temperaturunda qurulmasına icazə verilir. Tablet yapışan lentlə bağlanarsa, 4°C temperaturda bir neçə həftə saxlanıla bilər.

6. Tərkibində agaroza və antiserum qarışığı olan quyuya 10 µl parvovirus olan serum əlavə edin.

7. Qabaqcadan hazırlanmış karbon-formvar örtüyü olan elektron mikroskopiya şəbəkəsi bir damla zərdabın az parlaq tərəfinə yerləşdirilir.

8. Mesh 2 saat 37 °C-də nəmli kamerada saxlanılır.

9. İncə maqqaşlardan istifadə edərək, torunu çıxarın və zərdab ilə təmasda olan torun səthinə bir damcı 2% fosfotunqstik turşusu çəkin.

10. 30 saniyədən sonra artıq boya yuyulur, preparat qurudulur və virus inaktivləşdirilir.

Aqreqasiya olunmuş viral hissəciklər ötürücü elektron mikroskop altında 30.000-dən 50.000-ə qədər böyüdülmə ilə araşdırılır.

3. Viral antigenlərin identifikasiyası

Toxumalarda və ya toxuma mayelərində olan viruslar antigen-antikor reaksiyasından istifadə edərək virusa xas zülallar vasitəsilə müəyyən edilə bilər. Antigen-antikor reaksiyasının məhsulu birbaşa antiviral antikorlara və ya virusa spesifik antikorlara qarşı yönəldilmiş antikorlara daxil edilən etiketə qarşı sınaqdan keçirilir. Antikorlar floresein, radioaktiv yod və ya rəng dəyişikliyinə səbəb olan substratı parçalayan bir fermentlə etiketlənə bilər. Bundan əlavə, virusu müəyyən etmək üçün hemaqlütinasiya reaksiyasından istifadə olunur. Gündəlik praktikada təsvir olunan üsullar əsasən qanda hepatit B virusunun antigenlərini aşkar etmək və müxtəlif tənəffüs xəstəliklərinə səbəb olan müxtəlif virusların antigenlərini axtarmaq üçün istifadə olunur.

Hal-hazırda bir çox şirkətlər eritrosit, radioaktiv və enzimatik diaqnostika, o cümlədən hepatit B virusunu aşkar etmək üçün istifadə edirlər. Aşağıda nazofarengeal sekresiyada tənəffüs sinsitial virusunun müəyyən edilməsi üçün immunofluoressensiya üsuluna diqqət yetirəcəyik.

3.1 Nazofarenks sekresiyalarında respirator sinsitial virusun immunofluoressensiya ilə müəyyən edilməsi

Nazofarengeal sekresiya preparatlarının alınması üsulu Gardner və McQuillin tərəfindən təsvir edilmişdir. Laboratoriya şəraitində bu əməliyyat iki mərhələdə aparılır. Birincisi, bir şüşə slaydda nazofarengeal mucusun bir yaxması hazırlanır. Yaranan yaxmalar -20°C-də fiksasiya olunmuş şəkildə bir neçə ay saxlanıla bilər. İkinci mərhələdə respirator sinsitial virus antigenini aşkar etmək üçün yaxmalar boyanır. Bu məqsədlə dolayı immunofluoressensiya üsulundan istifadə olunur.

3.1.1 Nazofarenks sekresiyalarının preparatlarının hazırlanması

1. Xüsusi forsepslərdən olan selik 1-2 ml PBS ilə yuyulur və sentrifuqa borusuna köçürülür.

2. Stolüstü sentrifuqada 1500 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin.

3. Supernatant boşaldılır.

4. Hüceyrə qranulları homojen suspenziya alınana qədər 2-3 ml PBS-də diqqətlə yenidən suspenziya edilir. Bunun üçün geniş boyunlu Pasteur pipetindən istifadə edin.

5. Alınan suspenziya sınaq borusuna köçürülür.

6. Süspansiyona daha 2-4 ml PBS əlavə edin və pipetləmə ilə qarışdırın. Böyük mucus laxtaları çıxarılır.

7. Stolüstü sentrifuqada 1500 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin.

8. Supernatant atılır, çöküntü PBS-nin elə həcmində yenidən suspenziya edilir ki, yaranan süspansiyon borunun divarlarından asanlıqla ayrılsın.

9. Nəticədə süspansiyon işarələnmiş şüşə slaydı tətbiq olunur.

10. Şüşə havada qurudulur.

4°C temperaturda 10 dəqiqə asetonda bərkidin.

12. Fiksasiya edildikdən sonra şüşə yenidən havada qurudulur.

13. Nəticədə hazırlanan preparatlar dərhal boyanır və ya -20 ° C-də saxlanılır.

3.1.2. Boyama texnikası

1. PBS-də kommersiya RSV antiserumunu tövsiyə olunan iş konsentrasiyasına çap edin və seyreltin.

2. Pasteur pipetindən istifadə edərək hazırlanmış preparata bir damcı antiserum çəkin.

3. Dərman nəmli bir kameraya yerləşdirilir.

4. Dərman 30 dəqiqə 37 ° C-də inkubasiya edilir.

5. Xüsusi rezervuarda artıq antikorları çıxarmaq üçün nümunələr diqqətlə PBS ilə yuyulur.

6. Nümunələr hər biri 10 dəqiqə olmaqla üç növbədə PBS ilə yuyulur.

7. Nümunələri qurutun, artıq PBS-ni filtr kağızı ilə çıxarın və hava ilə qurudun.

Viruslar bakteriyalardan fərqli olaraq yalnız canlı hüceyrələrdə çoxalır. Bu baxımdan, virusların becərilməsi eksperimental bir heyvanın (bir toyuq embrionu, inkişaf edən bir orqanizm olaraq, eksperimental heyvan kimi təsnif edilir) və ya bədəndən kənarda böyüyən canlı hüceyrənin bədəni səviyyəsində həyata keçirilə bilər, yəni. hüceyrə mədəniyyəti səviyyəsində.

Laboratoriya heyvanlarının istifadəsi. Virusların təcrid edilməsi və becərilməsi üsullarından biri laboratoriya heyvanlarını yoluxdurmaqdır. Onlar hüceyrə mədəniyyətlərində sitopatik dəyişikliklərin inkişafına səbəb olmayan və toyuq embrionlarında çoxalmayan virusları təcrid etmək üçün istifadə olunur. Laboratoriya heyvanlarının istifadəsi də klinik simptomlar kompleksinə əsaslanaraq viral infeksiyanın təbiətini müəyyən etməyə imkan verir. İşin məqsədindən və tədqiq olunan virusların növündən asılı olaraq ən çox ağ siçanlar, hamsterlər, qvineya donuzları və dovşanlar laboratoriya heyvanları kimi istifadə olunur. Böyük heyvanlar arasında müxtəlif növ meymunlar və bəzi digər heyvanlar istifadə olunur. İstifadə olunan quşlara toyuqlar, qazlar və ördəklər daxildir. Son illərdə yeni doğulmuş heyvanlar (viruslara daha həssasdır), “steril heyvanlar” (uşaqlıqdan çıxarılaraq steril hava və sterilləşdirilmiş yemdən istifadə edilməklə steril şəraitdə saxlanılır) və irsiyyəti məlum olan təmiz nəsildən olan heyvanlar (inbred və ya xətti heyvanlar) daha çox olur. tez-tez istifadə olunur.

Təcrübəyə yalnız sağlam heyvanlar, tercihen bir uşaq bağçasından və bir partiyadan götürülür. Gündəlik dalğalanmalar olduğundan bədən istiliyi eyni vaxtda ölçülür. Test materialı virusların müəyyən toxumalara tropizmi nəzərə alınmaqla aparılır. Beləliklə, neytrotrop virusları təcrid etmək üçün material beyinə, pnevmotrop virusları təcrid etmək üçün - burun vasitəsilə (işıq efir anesteziyası altında) yeridilir.

Laboratoriya heyvanlarında, virus tərkibli materialla yoluxduqdan sonra, sonrakı tədqiqat üçün materialın vaxtında və düzgün götürülməsi və aseptik qaydada aparılması vacibdir. Müvafiq inkubasiya dövründən sonra heyvanda infeksiya simptomları yaranarsa, virus təcridinin nəticələri müsbət hesab olunur.

Toyuq embrionlarından istifadə. İnsan və heyvanların bir çox patogen virusları embrionun toxumalarında, onun membranlarında və yumurta sarısı kisəsində çoxala bilir. Bu zaman virusların müəyyən bir toxuma üçün seçiciliyi vacibdir: çiçək virusları yaxşı çoxalır və xorion-allantoik membranın hüceyrələrində toplanır, parotit virusu amnionda, qrip virusları amnion və allantoisdə, quduz virusu. sarısı kisəsində.

İnkişaf etməkdə olan embrionlarda virusların becərilməsi digər üsullarla müqayisədə bir sıra üstünlüklərə malikdir: sıx bir qabıq kifayət qədər etibarlı şəkildə daxili məzmunu mikroblardan qoruyur; toyuq embrionları yoluxduqda, digər becərmə üsullarına nisbətən daha çox virus tərkibli material əldə edilir; toyuq embrionlarının yoluxma üsulu sadədir və istənilən virusologiya laboratoriyaları üçün əlçatandır; embrionların kifayət qədər canlılığı və xarici patogenlərə qarşı müqaviməti var. Bununla belə, toyuq embrionları həmişə gizli viral və bakterial infeksiyalardan azad olmur. Virusla yoluxduqdan sonra embrionda baş verən patoloji dəyişikliklərin dinamikasını müşahidə etmək çətindir. Yoluxmuş embrionları açarkən, tez-tez görünən dəyişikliklər aşkar edilmir və hemaglutinasiya reaksiyası və digər üsullardan istifadə edərək virus aşkar edilir. Yoluxmuş embrionlarda antikor titrinin artmasına nəzarət etmək mümkün deyil. Metod bütün viruslar üçün uyğun deyil.

Viroloji tədqiqatlar üçün quşçuluq təsərrüfatlarından alınan 7-12 günlük embrionlardan istifadə olunur. Adi bir termostatda embrion yetişdirə bilərsiniz, bunun altında havanı nəmləndirmək üçün su ilə qablar yerləşdirilir. Termostatda temperatur 37 °C, havanın rütubəti isə 60-65% olmalıdır. 5-10 ° C temperaturda 10 gündən çox olmayan ağ toyuqlardan böyük, təmiz (lakin yuyulmamış), döllənmiş yumurtaları seçin. Döllənmiş yumurtalar, ovoskopla araşdırıldıqda qaranlıq bir ləkə kimi görünən bir germinal diskin olması ilə tanınır.

Viruslarla işləyərkən, embrionları yoluxdurmaq üçün müxtəlif üsullardan istifadə edilə bilər, lakin ən böyük praktik tətbiq virusu xorion-allantoik membrana tətbiq etmək, onu allantoik, amniotik boşluğa və yumurta sarısı kisəsinə daxil etməkdir.

(Şəkil 10.5). Metodun seçimi tədqiq olunan virusun bioloji xüsusiyyətlərindən asılıdır.

düyü. 10.5.

İnfeksiyadan əvvəl embrionun canlılığı bir ovoskopdan istifadə edərək müəyyən edilir. Canlı embrionlar mobildir, membranların damarlarının pulsasiyası aydın görünür. Ovoskopiya zamanı hava kisəsinin sərhədləri və ya qabıqdakı kölgəsi ilə müəyyən edilən embrionun yeri qabıq üzərində sadə qələmlə qeyd olunur.

Toyuq embrionları ciddi aseptik şəraitdə, qaynadılmış sterilizasiya edilmiş alətlərdən istifadə edərək qutuda yoluxdurulur.

Xorion-allantoik membranı yoluxdurarkən, 12 günlük embrionlar ən uyğun gəlir. İnfeksiya üçün 10-11 günlük rüşeymlər allantoik boşluğa, 7-11 günlük rüşeymlər amniotik boşluğa, 7 günlük rüşeymlər isə yumurta sarısı kisəsində istifadə olunur.

Yoluxmuş embrionları olan yumurtalar küt ucu ilə dayaqlara yerləşdirilir. Temperatur və inkubasiya müddəti aşılanmış virusun bioloji xüsusiyyətlərindən asılıdır. Embrionların canlılığı hər gün ovoskop altında yoxlanılır. İnfeksiyadan sonra ilk gündə zədə nəticəsində ölən embrionlar müayinə olunmur.

Materialı toplamazdan əvvəl, qan damarlarını daraltmaq və parçalanma zamanı qanaxmanın qarşısını almaq üçün embrionlar 4 ° C-də 18-20 saat ərzində soyudulur. Embrionlar aseptik qaydalara uyğun olaraq qutuda parçalanır.

Allantoik maye pipetlə aspire edilir, sterilliyə şəkər və ya ət-pepton bulyona vurulmaqla nəzarət edilir, hemaqlütinapiya reaksiyasında virusun olub-olmaması yoxlanılır və dondurulmuş vəziyyətdə 4°C-də saxlanılır.

Amniotik maye almaq üçün əvvəlcə allantoik maye sorulur, sonra dölün pərdəsi cımbızla tutulur, bir qədər yuxarı qaldırılır və Pasteur pipeti ilə amniotik maye sorulur.

Xorion-allantoik membrandakı dəyişiklikləri öyrənərkən, qayçı ilə kəsilir və bütün məzmunu deşikdən Petri qabına tökülür. Xorion-allantoik membran qabığın içərisində qalır və şoran məhlulu olan Petri qabına cımbızla çıxarılır. Burada yuyulur, düzəldilir və qaranlıq fonda fokus lezyonlarının təbiəti öyrənilir.

Amnion pərdəsini əldə etmək üçün embrionun qapalı olduğu amniotik kisə kəsilir və embriondan azad edilir və lezyonların olub-olmaması araşdırılır.

Vitellin pərdəsini almaq üçün xorion-allantois kəsilir, allantoik və amniotik mayelər sorulur, döl cımbızla çıxarılır, göbək ciyəsi ilə ayrılır, yumurta sarısı kisəsi tutulur və Petri qabına qoyulur. Sterilliyi yoxlayın və lezyonları yoxlayın. Əgər sarısını çıxarmaq lazım gələrsə, sarısı kisəsini çıxarmadan onu şprislə sormaq olar.

Yoluxmuş embrionun allantoik və amniotik mayelərində virusun olması hemaqlütinasiya reaksiyası ilə müəyyən edilir. Müsbət hemaqlütinasiya nəticəsi olan embrionların mayeləri sterillik yoxlanıldıqdan sonra birləşdirilir və geniş hemaqlütinasiya reaksiyasında titrlənir.

Az miqdarda virus varsa və ya test materialında onu aşkar etmək mümkün deyilsə, toyuq embrionlarında ardıcıl keçidlər aparılır. Embrionlarda üç sonrakı keçiddən sonra test materialında virus aşkar edilmirsə, nəticə mənfi hesab olunur.

Hüceyrə kulturalarının istifadəsi. Hüceyrələrin bədəndən kənarda yetişdirilməsi bir sıra şərtlərin yerinə yetirilməsini tələb edir. Onlardan biri iş zamanı sterilliyə ciddi riayət etməkdir, çünki istifadə olunan qida mühiti bakteriya və göbələklər üçün də əla qida substratı kimi xidmət edir. Toxuma hüceyrələri ağır metal duzlarına çox həssasdır. Buna görə də, şoran məhlulların və kultura mühitlərinin tərkibinə daxil olan müxtəlif inqrediyentlərin keyfiyyətinə, həmçinin hüceyrə kulturasında istifadə olunan qabların və rezin tıxacların emal üsullarına son dərəcə əhəmiyyət vermək lazımdır.

Hüceyrələrlə uğurlu iş üçün ilkin şərtlərdən biri yüksək keyfiyyətli distillə edilmiş sudur (həftədə iki dəfə yoxlanılır). Hüceyrələrlə işləmək üçün bidistillə edilmiş və ya deionlaşdırılmış su istifadə olunur. Ən yaxşı distillyatorlar şüşə və ya ərinti poladdan hazırlanmış cihazlardır: hüceyrələr üçün zəhərli olan ağır metal ionları belə avadanlıqdan yuyulmur. Deionlaşdırılmış su xüsusi qurğularda istehsal olunur, burada su anion və kation mübadilə qatranları ilə sütunlardan ardıcıl olaraq keçərək duzlardan təmizlənir.

Hüceyrələrin becərilməsi zamanı qabların və tıxacların hazırlanmasına və sterilizasiyasına xüsusilə böyük tələblər qoyulur. Bir çox hallarda hüceyrələrin şüşəyə yapışmamasına və ya hüceyrə monolayının sürətlə degenerasiyasına səbəb olan düzgün olmayan yuyulma və sterilizasiyadır.

Hüceyrələrin bədəndən kənarda böyüməsi və çoxalması üçün mürəkkəb fiziki-kimyəvi amillər dəsti tələb olunur: müəyyən bir temperatur, hidrogen ionlarının, qeyri-üzvi birləşmələrin, karbohidratların, amin turşularının, zülalların, vitaminlərin, oksigen və karbon qazının konsentrasiyası, buna görə də Hüceyrə mədəniyyətlərində virusların becərilməsi, kompleks qida mühitlərindən istifadə olunur. Tərkibinə daxil olan komponentlərin xarakterinə görə bu mühitlər iki qrupa bölünür.

• 1. Şoran məhlulların (Hanks, Erl və s.) və təbii komponentlərin (heyvan və insan qan zərdabı, albumin hidrolizat) qarışıqları olan media. Müxtəlif media reseptlərində bu komponentlərin hər birinin miqdarı fərqlidir.
• 2. Amin turşuları, vitaminlər, kofermentlər və nukleotidlər əlavə edilən şoran məhlullarından (Earl, Hanks və s.) ibarət sintetik və yarı sintetik mühitlər (Eagle media, 199 və s.). Sintetik mühitlərdə hüceyrələr qısa müddət ərzində (7 günə qədər) canlı vəziyyətdə ola bilər. Onları daha uzun müddət canlı vəziyyətdə saxlamaq, həmçinin hüceyrələrin böyüməsi və çoxalması üçün daha yaxşı şərait yaratmaq üçün sintetik mühitlərə heyvan qan zərdabı (inək, dana və s.) əlavə edilir.

Virusları təcrid etmək üçün bədəndən kənarda hüceyrələrin yetişdirilməsinin müxtəlif üsullarından istifadə edilə bilər. Bununla belə, hazırda birincil tripsinizləşdirilmiş və davamlı hüceyrə xətlərinin tək qatlı kulturaları ən böyük praktik tətbiqi əldə etmişdir. Bir qatlı hüceyrə kulturları 1 litr, 250 və 100 ml tutumlu şüşə düz divarlı döşək qablarda və ya müvafiq üsulla müalicə olunan adi bakterioloji borularda yetişdirilir.

İlkin tripsinizləşdirilmiş hüceyrə kulturalarından istifadə edərkən, metodun mahiyyəti şüşə səthində monolayerin böyüməsi üçün proteolitik fermentlər və ayrı-ayrı hüceyrələri olan toxumalarda hüceyrələrarası əlaqələri məhv etməkdir. Hüceyrələrin mənbəyi insan və heyvan embrionlarının, kəsilmiş heyvanların və quşların, həmçinin əməliyyat zamanı insanlardan çıxarılan toxuma və orqanlar ola bilər. Normal və bədxassəli degenerasiya olunmuş, epitelial, fibroblastik və qarışıq toxumalar istifadə olunur. Bədəndən çıxarılan hüceyrələri çoxaltmaq qabiliyyəti toxumaların fərqlənmə dərəcəsi ilə sıx bağlıdır. Toxuma nə qədər az fərqlənirsə, onun hüceyrələrinin in vitro proliferasiya qabiliyyəti bir o qədər intensiv olur. Buna görə də, embrion və şiş toxumalarından olan hüceyrələri bədəndən kənarda yetişdirmək, yetkin heyvanların normal hüceyrələrindən daha asandır.

Mədəniyyətlər böyümə nümunələrini müəyyən etmək üçün hər gün aşağı böyüdücü mikroskop altında yoxlanılır. Hüceyrələr çoxalmazsa, yumru, dənəvər, tünd görünür və şüşədən qabıqlanırsa, deməli, şüşə qablar zəif işlənmişdir və ya mədəniyyət mühitindəki inqrediyentlər zəhərlidir.

Virusların becərilməsi üçün birincil tripsinizləşdirilmiş toxumalarla yanaşı, davamlı hüceyrə mədəniyyətləri geniş istifadə olunur, yəni. bədəndən kənarda qeyri-müəyyən müddətə çoxalmağa qadir olan hüceyrələrin mədəniyyətləri. Ən çox istifadə edilən hüceyrə mədəniyyətləri normal və xərçəngli insan toxumalarından əldə edilənlərdir. Uşaqlıq boynu şişindən, qırtlaq karsinomasından Hep-2 və ağız xərçəngi toxumasından alınan KV-dən əldə edilən HeLa hüceyrə xətti geniş yayılmışdır. Belə hüceyrə kulturları normal heyvan toxumalarından - meymun, dovşan və donuz embrionunun böyrəklərindən də hazırlanır (cədvəl 10.1).

Transplantasiya edilmiş hüceyrələrin əkilməsi üçün qida mühiti pipetlə sorulur və çölə tökülür. Yaranan nazik hüceyrə təbəqəsi tripsin məhlulu ilə məhv edilir və beləliklə sərbəst buraxılan hüceyrələr təzə qida məhlulu ilə yeni bir qaba köçürülür, burada yenidən hüceyrələrin bir təbəqəsi əmələ gəlir.

Yoluxmuş hüceyrə mədəniyyətlərində virusun mövcudluğunun göstəricisi ola bilər:

• a) xüsusi hüceyrə degenerasiyasının inkişafı;
• b) hüceyrədaxili daxilolmaların aşkar edilməsi;
• c) immunofluoressensiya ilə spesifik antigenin aşkarlanması;
• d) müsbət hemadsorbsiya reaksiyası;
• e) müsbət hemaqlütinasiya reaksiyası;
• e) lövhələrin əmələ gəlməsi.

Cədvəl 10.1

Ən çox istifadə edilən davamlı hüceyrə mədəniyyətlərinin siyahısı

Yoluxmuş mədəniyyətlərdə spesifik degenerasiyanı müəyyən etmək üçün hüceyrələr hər gün aşağı böyüdücü mikroskop altında araşdırılır. Bir çox virus, hüceyrələrdə çoxaldıqda, onların degenerasiyasına səbəb olur, yəni. sitopatogen təsirə malikdir (CPE) (Şəkil 10.6).

düyü. 10.6.

Yoluxmuş hüceyrə kulturalarında sitopatik dəyişikliklərin inkişaf vaxtı və xarakteri aşılanmış virusun xüsusiyyətləri və dozası, həmçinin hüceyrə kulturasının xüsusiyyətləri və şəraiti ilə müəyyən edilir. Bəzi viruslar infeksiyadan sonra ilk həftə ərzində (çiçək, poliomielit, Coxsackie B virusları və s.), digərləri isə 1-2 həftədən sonra CPD-yə səbəb olur. infeksiyadan sonra (adenoviruslar, parainfluenza virusları, ECHO və s.).

Viruslar üç əsas tipli sitopatik dəyişikliklərə səbəb olur: bir çox hüceyrələrin sitoplazmasının birləşməsinin nəticəsi olan çoxnüvəli nəhəng hüceyrələrin və simplastların əmələ gəlməsi; hüceyrələrarası əlaqələrin itirilməsi və hüceyrələrin yuvarlaqlaşdırılması səbəbindən baş verən dəyirmi hüceyrə degenerasiyası; hüceyrələrin bir neçə qatından ibarət hüceyrə proliferasiya ocaqlarının inkişafı.

Bəzi viruslar hüceyrə mədəniyyətlərində çoxaldıqda, təsirlənmiş hüceyrələrin sitoplazmasında və ya nüvəsində hüceyrədaxili daxilolmalar əmələ gəlir. İnklüzyonları müəyyən etmək üçün hüceyrə kulturaları şüşə lövhələrdə sınaq borularında yetişdirilir, virusa yoluxdurulur və müəyyən bir inkubasiya dövründən sonra onları adi boyalarla boyanaraq preparatlar hazırlanır.

Yoluxmuş hüceyrə mədəniyyətlərində spesifik bir antigeni aşkar etmək üçün preparatlar MFA-dan istifadə edərək daxilolmaların aşkarlanması ilə eyni şəkildə hazırlanır.

Lövhə üsulu agar örtüyü altında virusla yoluxmuş hüceyrələrin monolayında degenerasiya olunmuş (ölü) hüceyrələrdən ibarət rəngsiz sahələrin əmələ gəlməsinə əsaslanır. Lövhə adlanan bu sahələr virusun koloniyalarıdır və adətən bir viral hissəcikdən əmələ gəlir.

Test materialı ilə yoluxmuş hüceyrə mədəniyyətlərində sitopatik dəyişikliklər, hüceyrədaxili daxilolmalar, lövhə meydana gəlməsi, hemadsorbsiya və hemaqlütinasiyanın mənfi reaksiyaları olmadıqda, iki sonrakı keçid aparılır. Son keçiddə bu dəyişikliklər olmadıqda, virus təcridinin nəticəsi mənfi hesab olunur.

Yoluxucu materialda virusları aşkar etmək üçün aşağıdakı üsullardan istifadə edilə bilər.

Mikroskopik:

• a) viroskopiya;
• b) hüceyrədaxili daxilolmaların aşkarlanması.

İmmunoloji:

• a) immun elektron mikroskopiyası;
• b) immunofluoressensiya;
• c) hemaqlütinasiya;
• d) hemadsorbsiya.

Virusların identifikasiyası immunoloji üsullardan, o cümlədən aşağıdakı reaksiyalardan istifadə etməklə həyata keçirilir:

• a) hemaqlütinasiyanın inhibə edilməsi;
• b) hemadsorbsiyada gecikmələr;
• c) komplementin fiksasiyası;
• d) zərərsizləşdirmə;
• e) agar geldə çökmə.

Mikroskopik üsullar. İşıq mikroskopundan istifadə etməklə yalnız 150 nm-dən böyük olan böyük virusları aşkar etmək olar. Daha kiçik virusların tanınması yalnız elektron mikroskopda mümkündür. Böyük virusları aşkar etmək üçün işıq, faza kontrastı və flüoresan mikroskopiya istifadə edilə bilər.

Viral infeksiyalar zamanı yoluxmuş hüceyrələrdə özünəməxsus daxilolmalar yaranır. Bəzi infeksiyalar təsirlənmiş hüceyrələrin sitoplazmasında (quduzluq, çiçək peyvəndi), digərləri - sitoplazmada və nüvədə (qızılca, təbii və suçiçəyi, adenoviral xəstəliklər) daxilolmaların meydana gəlməsi ilə müşayiət olunur. Daxilolmalar 0,25 ilə 25 mikron arasında fərqli bir təbiətə, quruluşa, forma və ölçüyə malikdir. Müasir məlumatlara görə, bəzi infeksiyalarda daxilolmalar virusun çoxalma yeridir və digərlərində hüceyrə degenerasiyasının məhsuludur;

Daxiletmələr orqan və toxumaların ləkələnmiş izlərində, hüceyrə qırıntılarında, təsirlənmiş toxumadan histoloji kəsiklərdə və virusla yoluxmuş hüceyrə mədəniyyəti preparatlarında aşkar edilə bilər. Rəngləmə tez-tez Romanovski-Giemsa üsulu ilə aparılır. Bu üsulla boyanma üçün preparatlar pikrik turşusu, formalin, spirt və sirkə turşusundan ibarət Dubosque-Brazil-Bouin qarışığında bərkidilir. Əksər viral infeksiyalarda hüceyrədaxili daxilolmalar oksifildir və Romanovski-Giemsa üsulu ilə çəhrayı və ya yasəmən rənginə boyanır.

Viral infeksiyaların diaqnostikası üçün immunoloji üsullar. Son illərdə bu üsullar virus infeksiyalarının laborator diaqnostikasında aparıcı yer tutur. Bu, əsasən iqtisadi səbəblərlə bağlıdır, çünki virusoloji analizin klassik üsulları kifayət qədər bahalıdır. Bundan əlavə, virusoloji üsullardan (həftələrlə) istifadə edilən tədqiqatların müddəti, kifayət qədər təsirli olsa da, onları retrospektiv edir.

İmmunoloji üsullar həm müxtəlif biosubstratlarda və ətraf mühit obyektlərində virus antigenlərinin aşkarlanması, həm də serodiaqnoz üçün - xəstə insanların və laboratoriya heyvanlarının qan serasında virus antigenlərinə qarşı anticisimlərin aşkarlanması üçün istifadə olunur. Bundan əlavə, immunoloji tədqiqat üsulları virionların müəyyən edilməsi üçün əvəzolunmazdır.

Bədənlə qarşılıqlı əlaqədə olan viruslar, virionlara adsorbsiya edildikdə, virionların hüceyrələrə nüfuz etməsinə və sitopatik təsirin (CPE) inkişafına mane olan antikorların meydana gəlməsinə səbəb olur; toyuq embrionlarında və heyvanların bədənində çoxalma zamanı virusların ölümcül təsirini neytrallaşdırmaq; virusun təsirinə məruz qalan hüceyrələrdə hemaqlütinasiya reaksiyasının (RHA) və hemadsorbsiya reaksiyasının (HRads) qarşısını alan virion hemaqlütininləri və neyraminidazaları inaktivləşdirir. Bu virusu neytrallaşdıran antikorlar həm də viral hissəciklərin aglütinasiyasına və çökməsinə səbəb olur və nəticədə yaranan immun komplekslər komplementi bağlayır. Buna görə də, virionları müəyyən etmək üçün hüceyrə kulturalarında, toyuq embrionlarında və heyvanlarda klassik neytrallaşma reaksiyasından (PH) və onun modifikasiyalarından istifadə olunur: hemaqlütinasiya inhibə reaksiyası (HAI); hemadsorbsiya inhibə reaksiyası (RTGads). Eyni reaksiyalar, məlum viral antigen (diaqnostikum) əsasında xəstələrin zərdabında virusu neytrallaşdıran anticisimləri aşkar etmək üçün virus infeksiyalarının serodiaqnozunda istifadə olunur.

İmmunelektron mikroskopiya (IEM) üsulu. Elektron mikroskopiya hazırda virusların öyrənilməsində mühüm rol oynayır. Virusların müasir təsnifatı üçün əsas olan elektron mikroskopiya məlumatlarıdır.

Virusların elektron mikroskopik tədqiqinin inkişafının yeni mərhələsi immunoelektron mikroskopiya üsullarının istifadəsidir. Bu üsuldan istifadə etməklə təkcə virusları birbaşa aşkar etmək deyil, həm də onları identifikasiya etmək, həmçinin virus ştammlarının sürətli serotipləşdirilməsi və onlara qarşı anticisimlərin titrlənməsi mümkün olub. IEM makroorqanizm hüceyrələrinin daxilində viral antigenlərin lokalizasiyasını təyin etmək üçün böyük əhəmiyyət kəsb etmişdir.

IEM-in şübhəsiz üstünlüyü adi elektron mikroskopiya üsulları ilə müqayisədə onun yüksək həssaslığıdır.

Virus antigeni və ya virus komponenti homoloji antiserum ilə təmasda olduqda, antikor-antigen kompleksi əmələ gəlir. Bu fenomen viral antigenləri və ya onlara qarşı antikorları aşkar etmək və müəyyən etmək üçün istifadə olunan texnikanın əsasını təşkil edir. Elektron mikroskopda müşahidə edilə bilən mənfi kontrastdan sonra antikorlarla antigenlərin bu kompleksləridir. Klinik diaqnostikada antigen material hərtərəfli təmizlənmə tələb etmir. Beləliklə, qrip virusu aşkar edilərsə, xam allantoik maye müayinə oluna bilər. İndi demək olar ki, hər hansı bir klinik materialın IEM üçün uyğun olduğuna inanılır. Diaqnostik məqsədlər üçün müntəzəm fraksiyalaşdırılmamış serum, həmçinin rekonvalesent serum istifadə edilə bilər. Qeyd etmək lazımdır ki, son nəticələrə antigen və antikorların miqdarının nisbəti böyük təsir göstərir. Antigenin artıqlığı olduqda, çoxlu hissəciklər müşahidə olunur; bu halda aglomeratların sayı az olacaq. Antikorların həddindən artıq olması halında, viral hissəciklər qalın bir təbəqə ilə əhatə olunur və virionun kiçik struktur detallarını müəyyən etmək demək olar ki, qeyri-mümkündür; vahidlərin sayı da azdır. Antigen və antikorların miqdarının optimal nisbəti ilə virionların detallarının yaxşı təsviri ilə aqreqatlar daha böyük olur. Yuxarıda göstərilən səbəblərə görə immun serumun bir neçə seyreltmə şəklində istifadə edilməsi məqsədəuyğundur.

Dəstək meshinə palladiumdan hazırlanmış bir dəstək filmi tətbiq olunur. Palladiumun aşağı konsentrasiyalarından istifadə edərkən və substratın adsorbsiya xüsusiyyətlərini yaxşılaşdırmaq üçün karbonla gücləndirilir. Bunun üçün karbon vakuumda elektron mikroskopik şəbəkədə hazır quru plyonka-substrat üzərinə səpilir. Substrat filminin və möhkəmləndirici karbon təbəqəsinin qalınlığı obyektin incə detallarının kontrastına və təsvirinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərir. Hər bir tədqiqatçı karbonun palladiumdan daha elektron şəffaf olmasına əsaslanaraq, substrat filmlərinin və karbon təbəqəsinin xüsusi qalınlığını fərdi olaraq müəyyən edir.

Viruslar və onlara qarşı antikorlar aşağı elektron sıxlığına malikdir. Buna görə də, bioloji obyektləri ilkin emal olmadan elektron mikroskopdan istifadə etməklə aşkar etmək mümkün deyil. Virusları vizuallaşdırmaq üçün mənfi kontrast (və ya mənfi ləkə) üsulu istifadə olunur. Virusların və virus-antikor komplekslərinin mənfi kontrastı üçün ağır metalların müxtəlif duzları istifadə olunur. Kontrast maddələr (ağır metal atomları) cisimlərin hidrofilik sahələrinə nüfuz edir və onlarda suyu əvəz edir. Nəticədə cismin elektron sıxlığı artır və onu elektron mikroskopda müşahidə etmək mümkün olur.

Birbaşa IEM metodu praktikada ən böyük tətbiq tapmışdır. Viral süspansiyon seyreltilmemiş antiserum ilə qarışdırılır. Güclü qarışdırdıqdan sonra qarışıq 1 saat inkubasiya edilir

37 ° C, sonra gecə 4 ° C-də. Ertəsi gün, qarışıq immun kompleksləri çökdürmək üçün sentrifuqa edilir. Çöküntü bir damcı distillə edilmiş suda yenidən dayandırılır və mənfi kontrasta məruz qalır.

IEM nəticələrini qiymətləndirərkən, elektron mikroskopda antigen və antikor arasındakı qarşılıqlı təsir məhsulları müxtəlif görünüşlərə malik ola bilər (antikorlarla tamamilə və ya qismən örtülmüş ayrıca viral hissəcik; viral hissəciklərin aglomeratları). Aqlomeratlar müxtəlif əraziləri tuta, fərqli görünüşlərə malik ola bilər və müxtəlif sayda hissəcikləri ehtiva edə bilər. Buna görə də, eksperimental olanlarla yanaşı, nəzarət preparatlarını (tampon məhlulu və ya heteroloji antiserum ilə) öyrənmək lazımdır.

IEM-dən istifadə etməklə əldə edilən nəticələrin qiymətləndirilməsi meyarı immun serumla yığılmış virus hissəciklərinin qruplarının preparatlarında olması və ya olmamasıdır. Antigen aglomeratlarının və spesifik antiserumun antikorlarının olması müsbət reaksiyanın əlamətidir. Bununla belə, yüksək sürətli sentrifuqanın təsiri altında antigen hissəciklərinin qeyri-spesifik aqreqasiyasının mümkünlüyü nəzərə alınmalıdır. Bu səbəbdən bir çox müəllif nəticələri 0-dan 4+-a qədər şərti miqyasda nəzərə almağı tövsiyə edir. O, yığılmış hissəciklərin serum antikorları ilə örtülmə dərəcəsinin qiymətləndirilməsinə əsaslanır.

Hemaqlütinasiya və hemadsorbsiya üsulları. Bir çox virus məməlilərin və quşların ciddi şəkildə müəyyən edilmiş növlərinin qırmızı qan hüceyrələrini aglütinasiya etmək qabiliyyətinə malikdir. Beləliklə, qrip və parotit virusları toyuqların, qvineya donuzlarının və insanların qırmızı qan hüceyrələrini aglütinləşdirir; gənə ensefalit virusu - qoyun eritrositləri; Yapon ensefalit virusları - bir günlük cücə və qazların qırmızı qan hüceyrələri; adenoviruslar - siçovulların, siçanların, meymunların eritrositləri. Hemaqlütinasiya reaksiyasında (HRA) sınaq materialı kimi allantoik və amniotik mayelər, toyuq embrionlarının xorion-allantoik membranlarının süspansiyonları, viruslarla yoluxmuş heyvanların hüceyrə və ya orqanlarının kulturalarından alınan süspansiyonlar və ekstraktlardan istifadə olunur. Hemaqlütinasiya reaksiyası şüşə üzərində damcı üsulu ilə və qatlanmamış cərgədə sınaq borularında və ya polistirol plitələrinin quyularında aparıla bilər. Birinci üsul göstəricidir.

Qrupa xas olan RGA virusların növlərini təyin etməyə imkan vermir. Onlar hemaqlütinasiya inhibe testi (HIT) istifadə edərək müəyyən edilir. Onun istehsalı üçün tanınmış immun antiviral serumlar istifadə olunur. Hər qatılmaya bərabər miqdarda virus tərkibli maye əlavə edilir. Nəzarət virusun dayandırılmasıdır.

Qarışıq bir termostatda saxlanılır, sonra qırmızı qan hüceyrələrinin bir süspansiyonu əlavə olunur. Bir neçə dəqiqədən sonra virusu neytrallaşdıran serumun titri müəyyən edilir, yəni. eritrositlərin aglütinasiyasının gecikməsinə səbəb olan onun maksimal seyreltilməsi.

Virus xəstəliklərinin seroloji diaqnostikasında biri xəstəliyin başlanğıcında, digəri isə 1-2 həftə və ya daha çox müddətdə əldə edilən qoşalaşmış zərdablarla RTGA-dan istifadə etmək tövsiyə olunur. İkinci zərdabda antikor titrinin dörd dəfə artması ehtimal olunan diaqnozu təsdiqləyir.

Hemadsorbsiya reaksiyası (RGads) yoluxmuş hüceyrə kulturalarında hemaglütinasiyaedici aktivliyə malik virusu göstərmək üçün istifadə olunur. Reaksiyanın mahiyyəti ondan ibarətdir ki, virusların hemaqlütinasiya təsirinə həssas olan qırmızı qan hüceyrələri viruslarla yoluxmuş hüceyrələrin səthində adsorbsiya edilir. Məsələn, toyuq eritrositləri variola virusu ilə yoluxmuş hüceyrələrə adsorbsiya edilir; qızılca virusu - meymunların eritrositləri; adenoviruslar - meymunlar və siçovullar və s.

Neytrallaşma reaksiyası (PH). Hüceyrə mədəniyyətlərində çoxaldıqda, viruslar yuvarlaqlaşdırma, qırışma, azalma və ya əksinə hüceyrələrin ölçüsünün artması, onların birləşməsi və simplastların formalaşması, sitoplazmanın və nüvənin məhv edilməsi ilə ifadə olunan müxtəlif CPE növlərinə səbəb olur. Nəhayət, viruslarla yoluxmuş hüceyrələrin bir qatında hüceyrə təbəqəsinin ayrı-ayrı hissələrinin məhv edilməsi nəticəsində virus hissəciyinin klonu olan “steril ləkələr” və ya lövhələr görünə bilər ki, bu da nəinki mümkün edir. virusu təcrid etmək, həm də titrini təyin etmək.

Lövhələrin təbiətinə görə virusu müəyyən etmək çox çətindir və buna görə də onlar virusu zərərsizləşdirən məlum seralarla təcrid olunmuş virusun pH-nı təyin etməyə müraciət edirlər. Bu məqsədlə xəstədən alınan virus hüceyrə kulturasında toplanır və onun müxtəlif seyreltmələri sulandırılmamış antiviral zərdab ilə qarışdırılır.

Virusların və serumların qarışığı toyuq embrionlarını və ya həssas heyvanları yoluxdurmaq üçün istifadə edilə bilər. Belə hallarda, antikorların neytrallaşdırıcı fəaliyyəti ən çox embrion mayelərində viral hemaqlütininləri neytrallaşdırmaq və virusun embrionlara və heyvanlara öldürücü təsirini aradan qaldırmaqla müəyyən edilir. Eyni zamanda, bir kimi qəbul edilən nəzarət eksperimentinin nəticələri ilə müqayisədə bu zərdab tərəfindən zərərsizləşdirilən virusun öldürücü dozalarının maksimum sayını ifadə edən zərərsizləşdirmə indeksi hesablanır.

Eynilə, PH istifadə edərək, xəstə materialından təcrid olunmuş viruslar toyuq embrionları və heyvanlar ona yoluxduqda müəyyən edilir. Bunun üçün virusu zərərsizləşdirən zərdablara virus tərkibli embrion mayeləri və təsirlənmiş heyvan orqanlarının süspansiyonları əlavə edilir. Müəyyən bir inkubasiya müddətindən sonra hüceyrə kulturaları, toyuq embrionları və heyvanlar qarışıqlarla yoluxur.

Viral infeksiyaların serodiaqnozunda məlum virus üçün virusu neytrallaşdıran anticisimlərin titrinin artması dinamikası müəyyən edilir. Bu zaman PH xəstəliyin əvvəlində və sonunda xəstələrdən alınan qoşalaşmış seralarla təyin edilir. Onlardan ikincisində immunoqlobulin titrinin 4 dəfə artması diaqnostik olacaq.

PH xüsusi antikorların viral hissəciklə kifayət qədər güclü bağlanma qabiliyyətinə əsaslanır. Virus və antikorun qarşılıqlı təsiri nəticəsində virus hissəciyinin həssas hüceyrələrlə əlaqəsinə cavabdeh olan antigen determinantların blokadası hesabına virusun infeksion fəaliyyəti neytrallaşdırılır. Nəticədə virus in vitro və ya in vivo ona həssas olan bioloji sistemdə çoxalma qabiliyyətini itirir.

PH nəticələri virus və homoloji antikorların qarışığı, müəyyən məruz qalma müddətindən sonra həssas bioloji sistemə (toxuma kulturası hüceyrələri, cücə embrionu, həssas heyvan) daxil edildikdən sonra aydın olur, burada virus çoxalır və ölçülə bilən dəyişikliklərə səbəb olur. antikorların iştirakı ilə qismən və ya tamamilə basdırılır.

PH-də iştirak edən üç komponent var:

• 1) virus;
• 2) tərkibində antikor olan serum;
• 3) seçimi tədqiqatın aparılacağı virusun növündən asılı olan bioloji obyekt (laboratoriya heyvanları, inkişaf edən toyuq embrionları, toxuma mədəniyyətləri).

PH ya təcrid olunmuş patogeni müəyyən etmək, ya da serumda antikorları aşkar etmək və titr etmək üçün istifadə olunur. Birinci halda, xüsusi immunlaşdırılmış laboratoriya heyvanlarının və ya sağalmış insanların seralarından istifadə edilir. İkinci halda, xəstəliyin ilkin mərhələsində və sağalma dövründə alınan zərdablardan istifadə edilir.

Sağalmış insanların zərdabında virusu zərərsizləşdirən anticisimlər, antihemaqlütininlərdən və ya tamamlayıcı anticisimlərdən fərqli olaraq, uzun illər, bəzi virus infeksiyalarında (məsələn, qızılca) hətta ömürlük qalır. Bu, bəzi hallarda ampulalara doldurulduqdan və liofilizasiyadan sonra uzun müddət diaqnostik iş üçün əlverişli olan bir çox rekonvalesentlərin sera hovuzundan istinad dərmanı kimi istifadə etməyə imkan verir.

İzolyasiya edilmiş patogenləri müəyyən edərkən müxtəlif heyvanların əvvəlcədən hazırlanmış hiperimmun seralarından istifadə olunur: dovşanlar, ağ siçovullar və siçanlar, qvineya donuzları, meymunlar, qoyunlar, atlar və s. PH üçün hiperimmun zərdabların fəaliyyəti heyvanların immunizasiya üsulundan asılıdır.

Hər bir zərərsizləşdirmə təcrübəsini yerinə yetirməzdən əvvəl, laboratoriya heyvanlarının (və ya toyuq embrionlarının) toxuma mədəniyyətinə və ya infeksiyasına səbəb olan son seyreltməni müəyyən etmək üçün virus əvvəlcədən titrlənir. Virus titri 50% doza kimi ifadə edilir (TCID50 - toxuma mədəniyyəti üçün 50% yoluxucu doza).

Viroloji praktikada molekulyar genetik diaqnostika üsulları. Molekulyar biologiyanın üsulları hələ 50-ci illərdə işlənib hazırlanmışdır. XX əsr. Onlar hər bir virusun genomunda hər hansı bir yoluxucu agenti müəyyən etmək üçün aşkar edilə bilən unikal növə xas nukleotid ardıcıllıqlarının olması səbəbindən mümkün olub. Bu üsullar adi üsullardan istifadə etməklə uzun müddət davam edən və ya yetişdirilməsi çətin olan mikroorqanizmlərin müəyyən edilməsində ən böyük əhəmiyyətə malikdir. 1970-ci illərdə radioaktiv izotop (və ya ftorxrom) ilə etiketlənmiş xüsusi oliqonukleotid zondlarının təcrid olunmuş DNT nümunəsinə hibridləşdirilməsinə əsaslanan DNT zondunun aşkarlanması yoluxucu patogen və ya mutasiyanı müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Hibridləşmə analizi müəyyən şəraitdə nuklein turşularının onları tamamlayan ardıcıllığı olan nuklein turşuları ilə xüsusi komplekslər yaratmaq qabiliyyətindən istifadə edir. DNT hibridizasiyası ilə yoluxucu patogenlərin aşkarlanması üsulu son dərəcə əmək tutumlu, vaxt aparan və bahalı oldu. Bundan əlavə, onun həssaslığı nəcis və sidik kimi klinik materiallarda mikroorqanizmləri müəyyən etmək üçün kifayət deyil.

DNT hibridləşməsi təbii DNT replikasiyasını təqlid edən və termofilik DNT polimerazadan istifadə edərək müəyyən bir DNT fraqmentinin aşkarlanmasına və təkrar kopyalanmasına imkan verən üsulla əvəz edilmişdir. Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) təbii DNT replikasiyasını təqlid edən və termofilik DNT polimeraza tərəfindən müəyyən bir DNT fraqmentinin aşkarlanmasına və dəfələrlə kopyalanmasına imkan verən zərif bir üsuldur.

Yüksək diaqnostik keyfiyyətlərinə görə, PCR virusologiyada istifadə olunan ənənəvi üsullara ümumi qəbul edilmiş əlavədir: hüceyrə mədəniyyətində virusun yayılması, viral antigenlərin immunoloji aşkarlanması, elektron mikroskopiya. Bu metodun əhəmiyyətli üstünlüyü gizli infeksiyalarda virusları (sitomeqalovirus, herpes virusu) və becərilməsi çətin və ya qeyri-mümkün olan virusları (insan immun çatışmazlığı virusu, Epstein-Barr virusu, insan papillomavirusu, Widr. hepatit virusu) aşkar etmək qabiliyyətidir. PCR metodu Creutzfeldt-Jakob xəstəliyi, Alzheimer və çox skleroz kimi xəstəliklərin öyrənilməsi perspektivləri ilə əlaqələndirilir.

ACI diaqnozu məcburi laboratoriya təsdiqi ilə klinik və epidemioloji məlumatlar əsasında qurulur. Laboratoriya təsdiqi olmadan, ACI diaqnozu yalnız dəqiq müəyyən edilmiş epidemioloji məlumatların olduğu hallarda (infeksiya ocaqlarında və xəstələrin əksəriyyətində laboratoriya tərəfindən deşifrlənmiş qrup xəstəliklərin yayılmasında) edilə bilər.

Son diaqnoz üçün bakterioloji, virusoloji və seroloji tədqiqat metodlarından istifadə olunur, həmçinin sigmoidoskopiyanın nəticələri (şigellyoz üçün) köməkçi əhəmiyyətə malikdir.

I. Bakterioloji üsul bakterial floranın səbəb olduğu kəskin bağırsaq infeksiyalarında (invaziv və sekretor ishal) böyük əhəmiyyət kəsb edir. Ən yaxşı nəticələr, antibakterial terapiya təyin etməzdən əvvəl nəcisin birbaşa xəstənin çarpayısına səpilməsi və toplandığı andan ilk iki saat ərzində bakterioloji laboratoriyaya çatdırılması ilə əldə edilir. Tədqiqat üçün qan deyil, patoloji çirkləri olan hissəcikləri seçmək lazımdır. Biomaterial Ploskirev, Levin və s. selektiv mühitlərə aşılanır. Nəcisin bakterioloji müayinəsinin mənfi nəticəsi 3-5-ci gün, müsbət nəticə isə, bir qayda olaraq, 5-7-ci gündə verilir. material bakterioloji laboratoriyaya çatdırılır. Kəskin bağırsaq infeksiyalarının tipik klinik təzahürlərinin mövcudluğunda belə müsbət nəticələrin tezliyi (patogenin mədəniyyəti və onun müəyyən edilməsi). 70-80%-dən çox deyil.

II. Seroloji üsullar diaqnostika, bir qayda olaraq, şübhəli hallarda və nəcisin bakterioloji müayinəsinin mənfi nəticələri ilə istifadə olunur. Birinci aylıq uşaqlarda. Həyatda çox informativ deyil, lakin bütün hallarda antikor titrinin 4 dəfə və ya daha çox artması vacibdir. Onlar iki istiqamətdə aparılır - xəstənin qan serumunda spesifik antikorların titrinin və nəcisdəki antigenin təyin edilməsi.

Xüsusi antikorların titrini təyin etmək üçün adətən RNGA, daha az tez-tez RPGA və ya RA istifadə olunur. Antigen kimi gündəlik bakteriya kulturasının (RA) və ya eritrosit diaqnostikumunun süspansiyonu alınır. ( RPGA, RNGA). Xəstəliyin gedişində antikor titrlərinin artması daha etibarlı hesab edilməlidir. Kəskin bağırsaq infeksiyası olan xəstənin qanında spesifik anticisimlər xəstəliyin 3-5-ci günündə yaranır və 2-3 həftə ərzində maksimuma yüksəlir, sonra isə tədricən azalır. Gənc uşaqlarda, xüsusən premorbid fonu dəyişdikdə, qanda spesifik antikorlar aşkar edilmir və ya aşağı titrə malikdir (1:50 – 1:100).

Tipik klinik simptomların olması və müvafiq diaqnostikası ilə spesifik anticisimlərin diaqnostik titrinin (1:200) və daha yüksək olması) və ya xəstəliyin dinamikasında onların titrinin artması halında bağırsaq infeksiyasının klinik diaqnostikası aparılmalıdır. xəstənin nəcisindən patogenin toxumu olmadıqda belə qurulmuş hesab olunur.

III. Ekspress diaqnostika üsulları bağırsaq infeksiyaları nəcisdən patogen antigenin (bakteriya və ya virus) aşkar edilməsinə əsaslanır, bunun üçün birbaşa luminescent antikor metodu (DMLA) və ya immunoadsorbsiya üsulu - karbon yığılma reaksiyası (CAR) istifadə olunur. İlkin nəticəni 2-3 saata, son nəticəni bir gündə əldə etmək olar. Metodun spesifikliyi 82-94,6% təşkil edir.

Son illərdə diareyanın sürətli diaqnostikası üçün fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (ELISA) və lateks aglütinasiya testi (LAR) istifadə edilmişdir.

Viral ishalın etioloji deşifrlənməsi virusoloji və bakterioloji üsullardan istifadə etməklə həyata keçirilir.

Nəcisdə virusların aşkarlanması üçün optimal dövr xəstəliyin 1-ci günündən 4-cü gününə qədər hesab olunur, baxmayaraq ki, patogen çox vaxt daha uzun müddət davam edir.

İstifadə olunan əsas üsul elektron mikroskopiyadır ki, bu da morfoloji xüsusiyyətlərə əsasən qastroenterit törədən geniş spektrli virus agentlərini müəyyən etməyə imkan verir.

İmmunoelektron mikroskopiyadan da istifadə olunur (homoloji zərdabların və ya sağalma zərdablarının iştirakı ilə virus hissəciklərinin immunoqlobulinlərlə rotavirus hissəciklərinin aqreqatlarını yaratmaq qabiliyyətinə əsaslanaraq).

Serodiaqnozun ənənəvi üsulları arasında neytrallaşma reaksiyası, hemaqlütinasiyanın inhibəsi və komplementlərin fiksasiyası daxildir. Rotavirusları və ya onların antigenlərini aşkar etmək üçün ELISA, diffuz çöküntü, lateks aglütinasiya və koaglütinasiya reaksiyasından istifadə olunur.

ELISA praktiki işdə ən geniş yer tutmuşdur. – koprofiltrlərdə rotavirus antigenlərinin təcrid edilməsi. Zamanla (xəstəxanaya yerləşdirmənin ilk günü və kliniki sağalmadan sonra) bu üsullardan istifadə etmək daha yaxşıdır.

Kəskin bağırsaq infeksiyalarının bakterial etiologiyasını istisna etmək üçün nəcisin bakterioloji müayinəsi qida mühitinə aşılama yolu ilə aparılır.

Siqmoidoskopiya Metod uşaqlarda nadir hallarda istifadə olunur, əsasən uzun müddət davam edən bakteriya ifrazının səbəbini müəyyən etmək və xəstəliyin uzanan və xroniki formalarını diaqnoz etmək üçün. Bu müayinə üsulu yalnız distal bağırsağın selikli qişalarında baş verən morfoloji dəyişikliklərin xarakterini qiymətləndirməyə imkan verir, lakin bağırsaq infeksiyasının etioloji diaqnozunu qoymaq üçün istifadə edilə bilməz.

Kəskin bağırsaq infeksiyaları üçün instrumental müayinə (ultrasəs, qarın boşluğu orqanlarının rentgen müayinəsi, FGS) üçün göstərişlər qarın orqanlarının cərrahi xəstəlikləri (invasepsiya, appendisit), somatik xəstəliklər (qastrit, mədə xorası, xolesistopankreatit və s.) və funksional pozğunluqlar mədə-bağırsaq traktının.

Uşaqlarda infeksion ishal zamanı toksikozun klinik formasının (neyrotoksikoz, toksikozlu toksikoz, İTS), dərəcəsinin (mərhələsinin), uşaqlarda infeksion ishal zamanı susuzlaşdırmanın növünün müəyyən edilməsi və təcili tibbi yardımın göstərilməsi.