Małe RNA. Wielkie okazje małych cząsteczek: jak małe RNA organizują geny bakteryjne

Zniszczenie docelowego mRNA może nastąpić także pod wpływem małego interferującego RNA (siRNA). Interferencja RNA to jedno z nowych, rewolucyjnych odkryć w biologii molekularnej, za które w 2002 roku jej autorzy otrzymali Nagrodę Nobla. Interferujące RNA bardzo różnią się strukturą od innych typów RNA i są dwiema komplementarnymi cząsteczkami RNA o długości około 21-28 zasad azotowych, które są ze sobą połączone jak nici w cząsteczce DNA. W tym przypadku dwa niesparowane nukleotydy zawsze pozostają na krawędziach każdego łańcucha siRNA. Wpływ przeprowadza się w następujący sposób. Kiedy cząsteczka siRNA znajdzie się wewnątrz komórki, w pierwszym etapie wiąże się w kompleks z dwoma enzymami wewnątrzkomórkowymi – helikazą i nukleazą. Kompleks ten nazwano RISC ( R NA- I wywołany S nieważne C złożony; cisza - angielski bądź cicho, zamknij się; wyciszanie – wyciszanie, tak w języku angielskim i literaturze specjalistycznej nazywa się proces „wyłączania” genu). Następnie helikaza rozwija i oddziela nici siRNA, a jedna z nici (o strukturze antysensownej) w kompleksie z nukleazą specyficznie oddziałuje z komplementarnym (ściśle mu odpowiadającym) regionem docelowego mRNA, co pozwala nukleazie ją przeciąć na dwie części. Wycięte fragmenty mRNA poddaje się następnie działaniu innych komórkowych nukleaz RNA, które dalej tną je na mniejsze kawałki.

SiRNA występujące w roślinach i niższych organizmach zwierzęcych (owadach) stanowią ważną część swego rodzaju „odporności wewnątrzkomórkowej”, która pozwala im rozpoznać i szybko zniszczyć obcy RNA. Jeśli do komórki dostanie się RNA zawierający wirusa, taki system ochrony zapobiegnie jego namnażaniu. Jeśli wirus zawiera DNA, system siRNA zapobiegnie wytwarzaniu białek wirusowych (ponieważ niezbędne do tego mRNA zostanie rozpoznane i wycięte), a zastosowanie tej strategii spowolni jego rozprzestrzenianie się po organizmie. Ustalono, że system siRNA jest niezwykle różnorodny: każdy siRNA rozpozna i zniszczy tylko swój własny, specyficzny mRNA. Zastąpienie tylko jednego nukleotydu w siRNA prowadzi do gwałtownego zmniejszenia efektu interferencji. Żaden ze znanych dotychczas blokerów genów nie posiada tak wyjątkowej specyficzności wobec swojego genu docelowego.

Obecnie metodę tę wykorzystuje się głównie w badaniach naukowych w celu identyfikacji funkcji różnych białek komórkowych. Jednak potencjalnie można go również wykorzystać do tworzenia leków.

Odkrycie interferencji RNA dało nową nadzieję w walce z AIDS i nowotworami. Możliwe jest, że stosując terapię siRNA w połączeniu z tradycyjnymi terapiami przeciwwirusowymi i przeciwnowotworowymi, można osiągnąć efekt wzmocnienia, w którym obie terapie dają większy efekt terapeutyczny niż zwykła suma każdego z nich podanych osobno.

Aby wykorzystać mechanizm interferencji siRNA w komórkach ssaków do celów terapeutycznych, należy wprowadzić do komórek gotowe dwuniciowe cząsteczki siRNA. Istnieje jednak szereg problemów, które obecnie nie pozwalają na wykonanie tego w praktyce, a tym bardziej na stworzenie jakichkolwiek postaci dawkowania. Po pierwsze, we krwi wpływa na nie pierwszy szczebel obrony organizmu, enzymy - nukleazy, które przecinają potencjalnie niebezpieczne i niezwykłe dla naszego organizmu podwójne nici RNA. Po drugie, pomimo swojej nazwy, małe RNA są wciąż dość długie, a co najważniejsze niosą ze sobą ujemny ładunek elektrostatyczny, co uniemożliwia ich bierną penetrację do wnętrza komórki. I po trzecie, jednym z najważniejszych pytań jest to, jak sprawić, aby siRNA działało (lub przenikało) tylko w niektórych („chorych”) komórkach, bez wpływu na zdrowe? I wreszcie pozostaje kwestia rozmiaru. Optymalny rozmiar takiego syntetycznego siRNA to te same 21-28 nukleotydów. Jeśli zwiększysz jego długość, komórki zareagują produkcją interferonu i zmniejszeniem syntezy białek. Z drugiej strony, jeśli spróbujesz użyć siRNA mniejszego niż 21 nukleotydów, specyficzność jego wiązania z pożądanym mRNA i zdolność do tworzenia kompleksu RISC gwałtownie spadają. Należy zauważyć, że przezwyciężenie tych problemów ma kluczowe znaczenie nie tylko w terapii siRNA, ale także w ogóle w terapii genowej.

Poczyniono już pewne postępy w ich rozwiązaniu. Na przykład naukowcy próbują zwiększyć wydajność cząsteczek siRNA poprzez modyfikacje chemiczne. lipofilowe, czyli zdolny do rozpuszczania się w tłuszczach tworzących błonę komórkową, ułatwiając w ten sposób przenikanie siRNA do wnętrza komórki. A żeby zapewnić specyfikę pracy tylko w obrębie określonych tkanek, inżynierowie genetyczni włączają do swoich konstruktów specjalne sekcje regulatorowe, które aktywują się i powodują odczytanie informacji zawartej w takim konstrukcie (a więc siRNA, jeśli jest w nim zawarty), tylko w niektórych tkankach komórkowych.

Dlatego naukowcy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego School of Medicine opracowali nowy, skuteczny system dostarczania do komórek małego interferującego RNA (siRNA), który hamuje wytwarzanie niektórych białek. System ten powinien stać się podstawą technologii dostarczania specyficznych leków do różnych typów nowotworów nowotworowych. „Małe interferujące RNA, które przeprowadzają proces zwany interferencją RNA, mają niesamowity potencjał w leczeniu raka” – wyjaśnia profesor Steven Dowdy, który kierował badaniami: „i chociaż wciąż mamy wiele do zrobienia, opracowaliśmy teraz technologia dostarczania leków do populacji komórek – zarówno nowotworu pierwotnego, jak i przerzutów, bez uszkadzania zdrowych komórek.”

Przez wiele lat Dowdy i jego współpracownicy badali potencjał przeciwnowotworowy małych interferujących RNA. Jednak konwencjonalne siRNA to maleńkie, ujemnie naładowane cząsteczki, które ze względu na swoje właściwości niezwykle trudno jest dostarczyć do komórek. Aby to osiągnąć, naukowcy wykorzystali krótkie białko sygnalizacyjne PTD (domena transdukcji peptydów). Wcześniej przy jego użyciu stworzono ponad 50 „białek hybrydowych”, w których PTD połączono z białkami supresorowymi nowotworów.

Jednak samo połączenie siRNA z PTD nie prowadzi do dostarczenia RNA do komórki: siRNA jest naładowany ujemnie, PTD jest naładowany dodatnio, co powoduje utworzenie gęstego konglomeratu RNA-białko, który nie jest transportowany przez błonę komórkową. Dlatego badacze najpierw połączyli PTD z domeną wiążącą białkowy RNA, która neutralizowała ładunek ujemny siRNA (w wyniku czego powstało białko fuzyjne zwane PTD-DRBD). Taki kompleks RNA-białko łatwo przechodzi przez błonę komórkową i wchodzi do cytoplazmy komórki, gdzie specyficznie hamuje białka informacyjne RNA, które aktywują wzrost nowotworu.

Aby przetestować zdolność białka fuzyjnego PTD-DRBD do dostarczania siRNA do komórek, naukowcy wykorzystali linię komórkową pochodzącą z ludzkiego raka płuc. Po potraktowaniu komórek PTD-DRBD-siRNA stwierdzono, że komórki nowotworowe były najbardziej wrażliwe na siRNA, podczas gdy w komórkach normalnych (jako kontroli użyto limfocytów T, komórek śródbłonka i embrionalnych komórek macierzystych), gdzie nie zaobserwowano zwiększonego wytwarzania substancji onkogennych białek, nie zaobserwowano żadnych skutków toksycznych.

Metodę tę można poddać różnym modyfikacjom wykorzystując różne siRNA do supresji różnych białek nowotworowych – nie tylko tych wytwarzanych w nadmiarze, ale także zmutowanych. Możliwa jest także modyfikacja terapii w przypadku nawrotu nowotworów, które na skutek nowych mutacji zwykle stają się oporne na leki stosowane w chemioterapii.

Choroby onkologiczne są bardzo zmienne, a charakterystyka molekularna białek komórek nowotworowych jest indywidualna dla każdego pacjenta. Autorzy pracy uważają, że w tej sytuacji najbardziej racjonalnym podejściem terapeutycznym jest zastosowanie małego interferującego RNA.

Małe RNA tworzące spinki do włosów lub krótkie RNA tworzące spinki do włosów (shRNA krótkie RNA o strukturze spinki do włosów, małe RNA o strukturze spinki do włosów) cząsteczki krótkich RNA tworzące gęste spinki do włosów w strukturze drugorzędowej. ShRNA można wykorzystać do wyłączenia ekspresji... ... Wikipedia

Polimeraza RNA- z komórki T. aquaticus podczas replikacji. Niektóre elementy enzymu stają się przezroczyste, a łańcuchy RNA i DNA są wyraźniej widoczne. Jon magnezu (żółty) znajduje się w miejscu aktywnym enzymu. Polimeraza RNA to enzym, który wykonuje ... ... Wikipedia

Interferencja RNA- Dostarczanie małych RNA zawierających spinki do włosów za pomocą wektora na bazie lentiwirusa i mechanizm interferencji RNA w komórkach ssaków Interferencja RNA (a... Wikipedia

Gen RNA- Niekodujący RNA (ncRNA) to cząsteczki RNA, które nie ulegają translacji na białka. Poprzednio używany synonim, małe RNA (smRNA, małe RNA), nie jest już używany, ponieważ niektóre niekodujące RNA mogą być bardzo ... ... Wikipedia

Małe jądrowe RNA- (snRNA, snRNA) klasa RNA występująca w jądrze komórek eukariotycznych. Są transkrybowane przez polimerazę RNA II lub polimerazę RNA III i biorą udział w ważnych procesach, takich jak splicing (usuwanie intronów z niedojrzałego mRNA), regulacja ... Wikipedia

Małe jąderkowe RNA- (snoRNA, ang. snoRNA) klasa małych RNA biorących udział w modyfikacjach chemicznych (metylacja i pseudourydylacja) rybosomalnego RNA, a także tRNA i małego jądrowego RNA. Według klasyfikacji MeSH małe jąderkowe RNA uznawane są za podgrupę... ...Wikipedia

małe jądrowe (jądrowe o niskiej masie cząsteczkowej) RNA- Rozległa grupa (105 106) małych jądrowych RNA (100 300 nukleotydów), związanych z heterogenicznym jądrowym RNA, jest częścią małych granulek rybonukleoproteinowych jądra; M.n.RNA są niezbędnym składnikiem systemu splicingu... ...

małe cytoplazmatyczne RNA- Małe (100-300 nukleotydów) cząsteczki RNA zlokalizowane w cytoplazmie, podobne do małego jądrowego RNA. [Arefyev V.A., Lisovenko L.A. Angielsko-rosyjski słownik objaśniający terminy genetyczne 1995 407 s.] Tematy genetyka EN scyrpssmall cytoplasmic... ... Przewodnik tłumacza technicznego

małe jądrowe RNA klasy U- Grupa związanych z białkami małych (od 60 do 400 nukleotydów) cząsteczek RNA, które stanowią znaczną część zawartości spplikomu i biorą udział w procesie wycinania intronów; w 4 z 5 dobrze zbadanych typów Usn, RNA U1, U2, U4 i U5 to 5... ... Przewodnik tłumacza technicznego

Biomarkery RNA- * Biomarkery RNA * Biomarkery RNA to ogromna liczba ludzkich transkryptów, które nie kodują syntezy białek (nsbRNA lub npcRNA). W większości przypadków małe (miRNA, snoRNA) i długie (antysensowne RNA, dsRNA i inne typy) cząsteczki RNA to... ... Genetyka. słownik encyklopedyczny

Książki

Kup za 1877 UAH (tylko Ukraina)
Genetyka kliniczna. Podręcznik (+CD), Bochkov Nikolay Pavlovich, Puzyrev Valery Pavlovich, Smirnikhina Svetlana Anatolyevna. Wszystkie rozdziały zostały poprawione i uzupełnione w związku z rozwojem nauk i praktyki medycznej. Rozdziały poświęcone chorobom wieloczynnikowym, profilaktyce, leczeniu chorób dziedzicznych,…

W żywej komórce przepływ informacji między jądrem a cytoplazmą nigdy nie wysycha, jednak zrozumienie wszystkich jej „zawirowań” i rozszyfrowanie zakodowanej w niej informacji to naprawdę herkulesowe zadanie. Za jeden z najważniejszych przełomów w biologii ostatniego stulecia można uznać odkrycie informacyjnych (lub matrycowych) cząsteczek RNA (mRNA lub mRNA), które służą jako pośrednicy przenoszący „wiadomości” informacyjne z jądra (z chromosomów) do cytoplazmy . Decydującą rolę RNA w syntezie białek przepowiedziano już w 1939 roku w pracy Thorbjörna Kasperssona ( Torbjörna Casperssona), Jeana Bracheta ( Jeana Bracheta) i Jacka Schultza ( Jacka Schultza), a w 1971 roku George Marbeis ( Jerzego Marbaixa) wywołał syntezę hemoglobiny w oocytach żaby poprzez wstrzyknięcie pierwszego wyizolowanego króliczego informacyjnego RNA kodującego to białko.

W latach 1956–1957 w Związku Radzieckim A. N. Belozersky i A. S. Spirin niezależnie udowodnili istnienie mRNA, a także odkryli, że większość RNA w komórce nie jest matrycą, ale rybosomalny RNA(rRNA). Rybosomalny RNA – drugi „główny” typ RNA komórkowego – tworzy „szkielet” i centrum funkcjonalne rybosomów we wszystkich organizmach; To rRNA (a nie białka) reguluje główne etapy syntezy białek. Jednocześnie opisano i zbadano trzeci „główny” typ RNA - transferowe RNA (tRNA), które w połączeniu z dwoma innymi - mRNA i rRNA - tworzą pojedynczy kompleks syntetyzujący białko. Według dość popularnej hipotezy „świata RNA”, to właśnie ten kwas nukleinowy leżał u samych początków życia na Ziemi.

Dzięki temu, że RNA jest znacznie bardziej hydrofilowe w porównaniu do DNA (ze względu na zastąpienie dezoksyrybozy rybozą), jest bardziej labilne i może stosunkowo swobodnie przemieszczać się w komórce, dzięki czemu dostarcza krótkotrwałe repliki informacji genetycznej (mRNA) do miejsca, w którym rozpoczyna się synteza białek. Warto jednak zwrócić uwagę na związaną z tym „niedogodność” – RNA jest bardzo niestabilne. Jest przechowywany znacznie gorzej niż DNA (nawet wewnątrz komórki) i ulega degradacji przy najmniejszej zmianie warunków (temperatura, pH). Oprócz „własnej” niestabilności duży udział mają rybonukleazy (lub RNazy) – klasa enzymów rozszczepiających RNA, które są bardzo stabilne i „wszechobecne” – nawet skóra dłoni eksperymentatora zawiera wystarczającą ilość tych enzymów, aby zanegować cały eksperyment. Z tego powodu praca z RNA jest znacznie trudniejsza niż z białkami czy DNA – to ostatnie można na ogół przechowywać przez setki tysięcy lat praktycznie bez uszkodzeń.

Fantastyczna opieka podczas pracy, tridestylat, sterylne rękawiczki, jednorazowe szkło laboratoryjne – to wszystko było niezbędne, aby zapobiec degradacji RNA, jednak utrzymanie takich standardów nie zawsze było możliwe. Dlatego przez długi czas po prostu nie zwracali uwagi na krótkie „fragmenty” RNA, które nieuchronnie zanieczyszczały roztwory. Jednak z biegiem czasu stało się jasne, że pomimo wszelkich wysiłków zmierzających do utrzymania sterylności miejsca pracy, w naturalny sposób nadal odkrywane są „zanieczyszczenia”, a potem okazało się, że w cytoplazmie zawsze znajdują się tysiące krótkich dwuniciowych RNA , pełniąc bardzo specyficzne funkcje i są absolutnie niezbędne do prawidłowego rozwoju komórek i organizmu.

Zasada interferencji RNA

Możliwość wykorzystania siRNA zainteresowali się także farmaceuci, gdyż zdolność do specyficznej regulacji funkcjonowania poszczególnych genów stwarza niespotykane dotąd perspektywy w leczeniu wielu chorób. Mały rozmiar i duża specyficzność działania zapewniają wysoką skuteczność i niską toksyczność leków opartych na siRNA; jednak rozwiązać problem dostawa siRNA do chorych komórek w organizmie nie zakończył się jeszcze sukcesem - wynika to z kruchości i kruchości tych cząsteczek. I chociaż dziesiątki zespołów próbują obecnie znaleźć sposób na skierowanie tych „magicznych kul” dokładnie w cel (wewnątrz chorych narządów), nie osiągnęły one jeszcze widocznego sukcesu. Poza tym są inne trudności. Przykładowo w przypadku terapii przeciwwirusowej wysoka selektywność działania siRNA może wyrządzić krzywdę – skoro wirusy szybko mutują, zmodyfikowany szczep bardzo szybko straci wrażliwość na wybrany na początku terapii siRNA: wiadomo, że zastąpienie tylko jednego nukleotydu w siRNA prowadzi do znacznego zmniejszenia efektu interferencji.

W tym miejscu warto jeszcze raz przypomnieć – odkryto siRNA tylko u roślin, bezkręgowców i organizmów jednokomórkowych; Chociaż homologi białek do interferencji RNA (Dicer, kompleks RISC) są również obecne u zwierząt wyższych, siRNA nie zostały wykryte konwencjonalnymi metodami. Cóż to było za zaskoczenie, kiedy sztucznie wprowadzone syntetyczne analogi siRNA powodowały silny, specyficzny, zależny od dawki efekt w hodowlach komórek ssaków! Oznaczało to, że w komórkach kręgowców interferencja RNA nie została zastąpiona przez bardziej złożony układ odpornościowy, ale ewoluowała wraz z organizmami, przekształcając się w coś bardziej „zaawansowanego”. W związku z tym u ssaków konieczne było poszukiwanie nie dokładnych analogów siRNA, ale ich ewolucyjnych następców.

Gracz nr 2 – mikroRNA

Rzeczywiście, w oparciu o dość starożytny ewolucyjnie mechanizm interferencji RNA, w organizmach bardziej rozwiniętych pojawiły się dwa wyspecjalizowane systemy kontrolowania działania genów, każdy wykorzystujący własną grupę małych RNA - mikroRNA(mikroRNA) i piRNA(piRNA, RNA oddziałujący z Piwi). Obydwa systemy pojawiły się w gąbkach i koelenteratach i wraz z nimi ewoluowały, wypierając siRNA i mechanizm interferencji „nagiego” RNA. Ich rola w zapewnianiu odporności maleje, gdyż funkcję tę przejmują bardziej zaawansowane mechanizmy odporności komórkowej, w szczególności układ interferonowy. Jednakże system ten jest na tyle czuły, że uruchamia także sam siRNA: pojawienie się małego dwuniciowego RNA w komórce ssaka wyzwala „sygnał alarmowy” (aktywuje wydzielanie interferonu i powoduje ekspresję genów zależnych od interferonu, co całkowicie blokuje wszystkie procesy tłumaczeniowe). Pod tym względem w mechanizmie interferencji RNA u zwierząt wyższych pośredniczą głównie mikroRNA i piRNA - jednoniciowe cząsteczki o specyficznej strukturze, które nie są wykrywane przez układ interferonu.

W miarę jak genom stawał się coraz bardziej złożony, mikroRNA i piRNA w coraz większym stopniu angażowały się w regulację transkrypcji i translacji. Z biegiem czasu zamieniły się w dodatkowy, precyzyjny i subtelny system regulacji genomu. W przeciwieństwie do siRNA, mikroRNA i piRNA (odkryte w 2001 r., patrz ramka 3) nie są wytwarzane z obcych cząsteczek dwuniciowego RNA, ale są początkowo kodowane w genomie gospodarza.

Poznaj: mikroRNA

Prekursor mikroRNA ulega transkrypcji z obu nici genomowego DNA przez polimerazę RNA II, w wyniku czego powstaje forma pośrednia – pri-microRNA – niosąca cechy zwykłego mRNA – m 7 G-cap i ogon poliA. Prekursor ten tworzy pętlę z dwoma jednoniciowymi „ogonami” i kilkoma niesparowanymi nukleotydami w środku (ryc. 3). Taka pętla poddawana jest dwuetapowej obróbce (ryc. 4): najpierw endonukleaza Drosha odcina jednoniciowe „ogony” RNA od spinki do włosów, po czym wycięty spinka do włosów (pre-microRNA) jest eksportowany do cytoplazmy, gdzie zostaje rozpoznany przez Dicera, który wykonuje jeszcze dwa cięcia (wycinany jest odcinek dwuniciowy, co zaznaczono kolorem na ryc. 3). W tej postaci dojrzały mikroRNA, podobnie jak siRNA, wchodzi w skład kompleksu RISC.

Rysunek 3. Struktura dwuniciowej cząsteczki prekursora mikroRNA. Główne cechy: obecność konserwatywnych sekwencji tworzących spinkę do włosów; obecność kopii komplementarnej (mikroRNA*) z dwoma „dodatkowymi” nukleotydami na końcu 3′; specyficzna sekwencja (2–8 pz), która tworzy miejsce rozpoznawane przez endonukleazy. Sam mikroRNA jest podświetlony na czerwono – to właśnie wycina Dicer.

Mechanizm działania wielu mikroRNA jest podobny do działania siRNA: krótki (21–25 nukleotydów) jednoniciowy RNA będący częścią kompleksu białkowego RISC wiąże się z dużą swoistością z miejscem komplementarnym w nieulegającym translacji regionie 3′ docelowy mRNA. Wiązanie prowadzi do rozszczepienia mRNA przez białko Ago. Jednak aktywność mikroRNA (w porównaniu z siRNA) jest już bardziej zróżnicowana – jeśli komplementarność nie jest absolutna, docelowy mRNA może nie ulec degradacji, a jedynie odwracalnie zablokowany (nie będzie translacji). Można również zastosować ten sam kompleks RISC sztucznie wprowadzone siRNA. To wyjaśnia, dlaczego siRNA utworzone przez analogię z pierwotniakami są również aktywne u ssaków.

W ten sposób możemy uzupełnić ilustrację mechanizmu działania interferencji RNA w organizmach wyższych (dwustronnie symetrycznych), łącząc na jednym rysunku diagram działania mikroRNA i siRNA wprowadzonych biotechnologicznie (ryc. 5).

Rycina 5. Uogólniony schemat działania sztucznych mikroRNA i siRNA(sztuczne siRNA wprowadza się do komórki za pomocą wyspecjalizowanych plazmidów - celujący w wektor siRNA).

Funkcje mikroRNA

Funkcje fizjologiczne mikroRNA są niezwykle zróżnicowane - w rzeczywistości pełnią one rolę głównych niebiałkowych regulatorów ontogenezy. mikroRNA nie znoszą, ale uzupełniają „klasyczny” schemat regulacji genów (induktory, supresory, zagęszczenie chromatyny itp.). Ponadto synteza samych mikroRNA jest kompleksowo regulowana (niektóre pule mikroRNA mogą być włączane przez interferony, interleukiny, czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α) i wiele innych cytokin). W efekcie powstaje wielopoziomowa sieć strojenia „orkiestry” tysięcy genów, zadziwiającej swoją złożonością i elastycznością, ale na tym się nie kończy.

mikroRNA są bardziej „uniwersalne” niż siRNA: geny „oddziałowe” nie muszą być w 100% komplementarne – regulacja odbywa się również poprzez częściową interakcję. Obecnie jednym z najgorętszych tematów w biologii molekularnej jest poszukiwanie mikroRNA, które pełnią rolę alternatywnych regulatorów znanych procesów fizjologicznych. Na przykład opisano już mikroRNA zaangażowane w regulację cyklu komórkowego i apoptozę u roślin, Drosophila i nicieni; u ludzi mikroRNA regulują układ odpornościowy i rozwój krwiotwórczych komórek macierzystych. Zastosowanie technologii opartych na biochipach (przesiewowe mikromacierze) pokazało, że całe pule małych RNA są włączane i wyłączane na różnych etapach życia komórki. Dla procesów biologicznych zidentyfikowano dziesiątki specyficznych mikroRNA, których poziom ekspresji w określonych warunkach zmienia się tysiące razy, co podkreśla wyjątkową sterowalność tych procesów.

Do niedawna uważano, że mikroRNA jedynie tłumią – całkowicie lub częściowo – pracę genów. Niedawno okazało się jednak, że działanie mikroRNA może się radykalnie różnić w zależności od stanu komórki! W aktywnie dzielącej się komórce mikroRNA wiąże się z komplementarną sekwencją w regionie 3' mRNA i hamuje syntezę białek (translację). Jednak w stanie spoczynku lub stresu (na przykład podczas uprawy w złym środowisku) to samo zdarzenie prowadzi do dokładnie odwrotnego efektu - zwiększonej syntezy docelowego białka!

Ewolucja mikroRNA

Liczba odmian mikroRNA w organizmach wyższych nie została jeszcze w pełni ustalona - według niektórych danych przekracza 1% liczby genów kodujących białka (u człowieka np. mówią, że jest ich 700 i jest to liczba stale rośnie). mikroRNA regulują aktywność około 30% wszystkich genów (dla wielu z nich cele nie są jeszcze znane), a istnieją cząsteczki zarówno wszechobecne, jak i specyficzne tkankowo - na przykład jedna z takich ważnych puli mikroRNA reguluje dojrzewanie pnia krwi komórki.

Szeroki profil ekspresji w różnych tkankach różnych organizmów i biologiczne występowanie mikroRNA wskazują na starożytne ewolucyjne pochodzenie. MikroRNA odkryto po raz pierwszy u nicieni i przez długi czas uważano, że cząsteczki te występują jedynie w gąbkach i koelenteratach; jednakże odkryto je później w algach jednokomórkowych. Co ciekawe, w miarę jak organizmy stają się coraz bardziej złożone, wzrasta również liczba i niejednorodność puli miRNA. Pośrednio wskazuje to, że złożoność tych organizmów zapewnia w szczególności funkcjonowanie mikroRNA. Możliwą ewolucję miRNA pokazano na rycinie 6.

Rycina 6. Różnorodność mikroRNA w różnych organizmach. Im wyższa organizacja organizmu, tym więcej znajduje się w nim mikroRNA (liczba w nawiasach). Gatunki, u których je stwierdzono, zaznaczono na czerwono. pojedynczy mikroRNA.

Można wyciągnąć wyraźne powiązanie ewolucyjne pomiędzy siRNA i mikroRNA w oparciu o następujące fakty:

działanie obu typów jest wymienne i pośredniczą w nim białka homologiczne;
siRNA wprowadzone do komórek ssaków specyficznie „wyłączają” pożądane geny (pomimo pewnej aktywacji ochrony interferonem);
MikroRNA odkrywa się w coraz starszych organizmach.

Te i inne dane sugerują pochodzenie obu systemów od wspólnego „przodka”. Warto również zauważyć, że odporność „RNA” jako niezależny prekursor przeciwciał białkowych potwierdza teorię pochodzenia pierwszych form życia opartą na RNA, a nie na białkach (przypomnijmy, że jest to ulubiona teoria akademika A.S. Spirina) .

Im dalej idziesz, tym bardziej zagmatwane staje się. Gracz nr 3 – piRNA

Chociaż na arenie biologii molekularnej było tylko dwóch „graczy” – siRNA i mikroRNA – główny „cel” interferencji RNA wydawał się całkowicie jasny. Rzeczywiście: zestaw homologicznych krótkich RNA i białek w różnych organizmach wykonuje podobne działania; W miarę jak organizmy stają się coraz bardziej złożone, wzrasta także funkcjonalność.

Jednak w procesie ewolucji natura stworzyła inny, ewolucyjnie najnowszy i wysoce wyspecjalizowany system oparty na tej samej skutecznej zasadzie interferencji RNA. Mówimy o piRNA (piRNA, z RNA interakcji Piwi).

Im bardziej złożony jest genom, tym bardziej rozwinięty i przystosowany jest organizm (lub odwrotnie? ;-). Jednak wzrost złożoności genomu ma również wadę: staje się złożonym systemem genetycznym nietrwały. Prowadzi to do konieczności istnienia mechanizmów odpowiedzialnych za utrzymanie integralności genomu – w przeciwnym razie spontaniczne „mieszanie” DNA po prostu go unieruchomi. Ruchome elementy genetyczne ( MGE) – jeden z głównych czynników niestabilności genomu – to krótkie, niestabilne regiony, które mogą ulegać autonomicznej transkrypcji i migrować po całym genomie. Aktywacja takich elementów transpozycyjnych prowadzi do wielokrotnych pęknięć DNA w chromosomach, co może mieć śmiertelne konsekwencje.

Liczba MGE rośnie nieliniowo wraz z rozmiarem genomu, a ich aktywność musi być ograniczona. Aby to zrobić, zwierzęta, zaczynając od koelenteratów, wykorzystują to samo zjawisko interferencji RNA. Tę funkcję pełnią także krótkie RNA, ale nie te, które już omawialiśmy, ale ich trzeci rodzaj – piRNA.

„Portret” piRNA

Funkcje piRNA

Główną funkcją piRNA jest tłumienie aktywności MGE na poziomie transkrypcji i translacji. Uważa się, że piRNA są aktywne jedynie w okresie embriogenezy, kiedy nieprzewidywalne przetasowanie genomu jest szczególnie niebezpieczne i może doprowadzić do śmierci zarodka. To logiczne – kiedy układ odpornościowy jeszcze nie zaczął działać, komórki zarodka potrzebują prostej, ale skutecznej ochrony. Zarodek jest niezawodnie chroniony przed zewnętrznymi patogenami przez łożysko (lub skorupę jaja). Ale oprócz tego konieczna jest także obrona przed wirusami endogennymi (wewnętrznymi), przede wszystkim MGE.

Ta rola piRNA została potwierdzona doświadczeniem – „knockout”, czyli mutacje genów Ago3, Piwi czy Aub prowadzą do poważnych zaburzeń rozwojowych (i gwałtownego wzrostu liczby mutacji w genomie takiego organizmu), a także powodują niepłodność z powodu zakłócenia rozwoju komórek rozrodczych.

Dystrybucja i ewolucja piRNA

Pierwsze piRNA znaleziono już w ukwiałach i gąbkach. Rośliny najwyraźniej poszły inną drogą – nie znaleziono w nich białek Piwi, a rolę „kagańca” dla transpozonów pełni endonukleaza Ago4 i siRNA.

U zwierząt wyższych – w tym ludzi – system piRNA jest bardzo dobrze rozwinięty, lecz można go znaleźć jedynie w komórkach embrionalnych i śródbłonku owodniowym. Czas pokaże, dlaczego dystrybucja piRNA w organizmie jest tak ograniczona. Można założyć, że jak każda potężna broń, piRNA przynoszą korzyść tylko w bardzo specyficznych warunkach (podczas rozwoju płodu), a w dorosłym organizmie ich działanie przyniesie więcej szkody niż pożytku. Mimo to liczba piRNA jest o rząd wielkości większa niż liczba znanych białek, a niespecyficzne działanie piRNA w dojrzałych komórkach jest trudne do przewidzenia.

Tabela 1. Właściwości wszystkich trzech klas krótkich RNA

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Rozpościerający się	Rośliny, Drosophila, C. elegancja. Nie występuje u kręgowców	Eukarionty	Komórki embrionalne zwierząt (począwszy od koelenteratów). Nie u pierwotniaków i roślin
Długość	21–22 nukleotydów	19–25 nukleotydów	24–30 nukleotydów
Struktura	Dwuniciowy, 19 komplementarnych nukleotydów i dwa niesparowane nukleotydy na końcu 3′	Jednołańcuchowa złożona struktura	Jednołańcuchowa złożona struktura. U na końcu 5′ i końcu 2′ O-metylowany koniec 3'
Przetwarzanie	Zależne od Dicera	Zależne od Dicera	Niezależny od Dicera
Endonukleazy	temu2	temu1, temu2	temu3, Piwi, Aub
Działalność	Degradacja komplementarnych mRNA, acetylacja genomowego DNA	Degradacja lub hamowanie translacji docelowego mRNA	Degradacja mRNA kodującego MGE, regulacja transkrypcji MGE
Rola biologiczna	Przeciwwirusowa obrona immunologiczna, tłumienie aktywności własnych genów	Regulacja aktywności genów	Tłumienie aktywności MGE podczas embriogenezy

Wniosek

Podsumowując, chciałbym przedstawić tabelę ilustrującą ewolucję aparatu białkowego biorącego udział w interferencji RNA (ryc. 9). Można zauważyć, że pierwotniaki mają najbardziej rozwinięty system siRNA (rodziny białek Ago, Dicer), a w miarę jak organizmy stają się bardziej złożone, nacisk przesuwa się na układy bardziej wyspecjalizowane – liczbę izoform białek dla mikroRNA (Drosha, Pasha) i piRNA ( Piwi, Hen1) wzrasta. Jednocześnie zmniejsza się różnorodność enzymów pośredniczących w działaniu siRNA.

Rysunek 9. Różnorodność białek biorących udział w interferencji RNA(cyfry wskazują liczbę białek w każdej grupie). Niebieski elementy charakterystyczne dla siRNA i mikroRNA są podświetlone, oraz czerwony- białko I związane z piRNA.

Zjawisko interferencji RNA zaczęły wykorzystywać najprostsze organizmy. W oparciu o ten mechanizm natura stworzyła prototyp układu odpornościowego, a w miarę jak organizmy stają się coraz bardziej złożone, interferencja RNA staje się niezbędnym regulatorem aktywności genomu. Dwa różne mechanizmy plus trzy typy krótkich RNA ( cm. patka. 1) - w rezultacie widzimy tysiące drobnych regulatorów różnych szlaków metabolicznych i genetycznych. Ten uderzający obraz ilustruje wszechstronność i ewolucyjną adaptację systemów biologii molekularnej. Krótkie RNA po raz kolejny udowadniają, że we wnętrzu komórki nie ma „małych rzeczy” – są jedynie małe cząsteczki, których pełne znaczenie dopiero zaczynamy rozumieć.

(To prawda, taka fantastyczna złożoność sugeruje raczej, że ewolucja jest „ślepa” i działa bez wcześniej zatwierdzonego „głównego planu””;

Andrew Grimson, Mansi Srivastava, Bryony Fahey, Ben J. Woodcroft, H. Rosaria Chiang i in. al.. (2008). Wczesne pochodzenie i ewolucja mikroRNA i RNA oddziałujących z Piwi u zwierząt. Natura. 455 , 1193-1197;

AA Aravin, G. J. Hannon, J. Brennecke. (2007). Ścieżka Piwi-piRNA zapewnia obronę adaptacyjną w wyścigu zbrojeń transpozonowych. Nauka. 318 , 761-764;

Metafora leżąca u podstaw nazwy zjawiska interferencji RNA nawiązuje do eksperymentu z petunią, kiedy sztucznie wprowadzone do rośliny geny syntetazy pigmentu różowego i fioletowego nie zwiększały intensywności barwy, a wręcz przeciwnie, ją zmniejszały. Podobnie w przypadku „zwykłej” interferencji nałożenie dwóch fal może prowadzić do wzajemnego „zniesienia”.

W żywej komórce przepływ informacji między jądrem a cytoplazmą nigdy nie wysycha, jednak zrozumienie wszystkich jej „zawirowań” i rozszyfrowanie zakodowanej w niej informacji to naprawdę herkulesowe zadanie. Za jeden z najważniejszych przełomów w biologii ostatniego stulecia można uznać odkrycie informacyjnych (lub matrycowych) cząsteczek RNA (mRNA lub mRNA), które służą jako pośrednicy przenoszący „wiadomości” informacyjne z jądra (z chromosomów) do cytoplazmy . Decydującą rolę RNA w syntezie białek przepowiedziano już w 1939 r. w pracach Torbjörna Casperssona, Jeana Bracheta i Jacka Schultza, a w 1971 r. George Marbaix zapoczątkował syntezę hemoglobiny w oocytach żab poprzez wstrzyknięcie pierwszego wyizolowanego króliczego informacyjnego RNA kodującego to białko .

W latach 1956-57 w Związku Radzieckim A. N. Belozersky i A. S. Spirin niezależnie udowodnili istnienie mRNA, a także odkryli, że większość RNA w komórce to nie matryca, ale rybosomalny RNA (rRNA). Rybosomalny RNA, drugi „główny” typ RNA komórkowego, tworzy „szkielet” i centrum funkcjonalne rybosomów we wszystkich organizmach; To rRNA (a nie białka) reguluje główne etapy syntezy białek. Jednocześnie opisano i zbadano trzeci „główny” typ RNA - transferowe RNA (tRNA), które w połączeniu z dwoma innymi - mRNA i rRNA - tworzą pojedynczy kompleks syntetyzujący białko. Według dość popularnej hipotezy „świata RNA”, to właśnie ten kwas nukleinowy leżał u samych początków życia na Ziemi.

Zasada interferencji RNA

Obecnie badanie małych regulatorowych RNA jest jedną z najszybciej rozwijających się dziedzin biologii molekularnej. Odkryto, że wszystkie krótkie RNA spełniają swoje funkcje w oparciu o zjawisko zwane interferencją RNA (istotą tego zjawiska jest tłumienie ekspresji genów na etapie transkrypcji lub translacji przy aktywnym udziale małych cząsteczek RNA). Mechanizm interferencji RNA pokazano bardzo schematycznie na ryc. 1:

Ryż. 1. Podstawy interferencji RNA
Cząsteczki dwuniciowego RNA (dsRNA) są rzadkością w normalnych komórkach, ale stanowią istotny etap w cyklu życiowym wielu wirusów. Specjalne białko zwane Dicer, po wykryciu dsRNA w komórce, „tnie” je na małe fragmenty. Nić antysensowna takiego fragmentu, który można już nazwać krótkim interferującym RNA (siRNA, od siRNA – small interferencyjny RNA), jest związana przez kompleks białek zwany RISC (ang. RNA-operative Silencing Complex), którego centralnym elementem jest endonukleaza z rodziny Argonaute. Wiązanie z siRNA aktywuje RISC i inicjuje poszukiwanie w komórce cząsteczek DNA i RNA, które są komplementarne do „wzorcowego” siRNA. Losem takich cząsteczek jest zniszczenie lub inaktywacja przez kompleks RISC.

Podsumowując, krótkie „cięcia” obcego (w tym celowo wprowadzonego) dwuniciowego RNA służą jako „szablon” do poszukiwania na dużą skalę i niszczenia komplementarnego mRNA (co jest równoznaczne z tłumieniem ekspresji odpowiedniego genu) nie tylko w jednej komórce, ale także w sąsiednich. Dla wielu organizmów - pierwotniaków, mięczaków, robaków, owadów, roślin - zjawisko to jest jednym z głównych sposobów obrony immunologicznej przed infekcjami.

W 2006 roku Andrew Fire i Craig Mello otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny „za odkrycie zjawiska interferencji RNA – mechanizmu wyciszania genów z udziałem dsRNA”. Choć samo zjawisko interferencji RNA opisano już dawno (już na początku lat 80. XX w.), to dopiero prace Fire’a i Mello nakreśliły mechanizm regulacyjny małych RNA i nakreśliły nieznany dotąd obszar badań molekularnych. Oto główne rezultaty ich pracy:

Podczas interferencji RNA rozszczepiane jest mRNA (a nie inne);
Dwuniciowy RNA działa (powoduje rozszczepienie) znacznie skuteczniej niż jednoniciowy RNA. Te dwie obserwacje przewidywały istnienie wyspecjalizowanego układu pośredniczącego w działaniu dsRNA;
dsRNA, komplementarny do odcinka dojrzałego mRNA, powoduje rozszczepienie tego ostatniego. Wskazywało to na cytoplazmatyczną lokalizację procesu i obecność specyficznej endonukleazy;
Niewielka ilość dsRNA (kilka cząsteczek na komórkę) wystarczy, aby całkowicie „wyłączyć” gen docelowy, co wskazuje na istnienie kaskadowego mechanizmu katalizy i/lub amplifikacji.

Wyniki te położyły podwaliny pod cały obszar współczesnej biologii molekularnej – interferencję RNA – i na dziesięciolecia wyznaczyły wektor prac wielu grup badawczych na całym świecie. Do chwili obecnej odkryto trzy duże grupy małych RNA, które odgrywają w polu molekularnym rolę „zespołu interferującego RNA”. Poznajmy je bardziej szczegółowo.

Gracz nr 1 – krótki interferujący RNA

O specyfice interferencji RNA decyduje krótki interferujący RNA (siRNA) – małe dwuniciowe cząsteczki RNA o wyraźnie określonej strukturze (patrz ryc. 2).

siRNA są najwcześniejsze w ewolucji i są najbardziej rozpowszechnione w roślinach, organizmach jednokomórkowych i bezkręgowcach. U kręgowców praktycznie nie stwierdza się siRNA, ponieważ zostały one zastąpione późniejszymi „modelami” krótkich RNA (patrz poniżej).

siRNA – „szablony” do przeszukiwania cytoplazmy i niszczenia cząsteczek mRNA – mają długość 20–25 nukleotydów i „cechę szczególną”: 2 niesparowane nukleotydy na końcach 3’ i fosforylowane końce 5’. Antysensowny siRNA jest w stanie (oczywiście nie sam, ale przy pomocy kompleksu RISC) rozpoznać mRNA i specyficznie spowodować jego degradację: docelowy mRNA jest cięty dokładnie w miejscu komplementarnym do 10. i 11. nukleotydu antysensowny łańcuch siRNA.

Ryż. 2. Mechanizm „interferencji” pomiędzy mRNA i siRNA
„Interferujące” krótkie cząsteczki RNA mogą albo przedostać się do komórki z zewnątrz, albo zostać „wycięte” z dłuższego dwuniciowego RNA. Głównym białkiem wymaganym do cięcia dsRNA jest endonukleaza Dicer. „Wyłączenie” genu poprzez mechanizm interferencyjny odbywa się za pomocą siRNA wraz z kompleksem białkowym RISC, na który składają się trzy białka – endonukleaza Ago2 oraz dwa białka pomocnicze PACT i TRBP. Później odkryto, że kompleksy Dicer i RISC mogą wykorzystywać jako „nasiono” nie tylko dsRNA, ale także jednoniciowy RNA tworzący dwuniciową spinkę do włosów, a także gotowy siRNA (ten ostatni omija „cięcie” etapie i natychmiast wiąże się z RISC).

Funkcje siRNA w komórkach bezkręgowców są dość zróżnicowane. Pierwszą i najważniejszą rzeczą jest ochrona immunologiczna. „Tradycyjny” układ odpornościowy (limfocyty + leukocyty + makrofagi) występuje tylko w złożonych organizmach wielokomórkowych. U organizmów jednokomórkowych, bezkręgowców i roślin (które albo nie mają takiego systemu, albo jest on w powijakach) obrona immunologiczna opiera się na interferencji RNA. Odporność oparta na interferencji RNA nie wymaga skomplikowanych narządów „trenujących” prekursorów komórek odpornościowych (śledziona, grasica); jednocześnie różnorodność teoretycznie możliwych krótkich sekwencji RNA (421 wariantów) jest skorelowana z liczbą możliwych przeciwciał białkowych zwierząt wyższych. Ponadto siRNA syntetyzowane są na bazie „wrogiego” RNA, który zainfekował komórkę, co oznacza, że w przeciwieństwie do przeciwciał są natychmiast „dopasowywane” do konkretnego rodzaju infekcji. I choć ochrona oparta na interferencji RNA nie działa poza komórką (przynajmniej nie ma jeszcze takich danych), to zapewnia odporność wewnątrzkomórkową bardziej niż zadowalająco.

Przede wszystkim siRNA tworzy odporność przeciwwirusową poprzez niszczenie mRNA lub genomowego RNA organizmów zakaźnych (tak np. odkryto siRNA w roślinach). Wprowadzenie wirusowego RNA powoduje silną amplifikację specyficznych siRNA w oparciu o cząsteczkę startera - sam wirusowy RNA. Ponadto siRNA tłumią ekspresję różnych ruchomych elementów genetycznych (MGE), a zatem zapewniają ochronę przed endogennymi „infekcjami”. Mutacje w genach kompleksu RISC często prowadzą do zwiększonej niestabilności genomu ze względu na wysoką aktywność MGE; siRNA może działać jako ogranicznik ekspresji własnych genów, uruchamiając się w odpowiedzi na ich nadekspresję. Regulacja funkcji genów może zachodzić nie tylko na poziomie translacji, ale także podczas transkrypcji – poprzez metylację genów na histonie H3.

We współczesnej biologii eksperymentalnej nie można przecenić znaczenia interferencji RNA i krótkich RNA. Opracowano technologię „wyłączania” (lub niszczenia) poszczególnych genów in vitro (na hodowlach komórkowych) i in vivo (na embrionach), co stało się już de facto standardem przy badaniu dowolnego genu. Czasem nawet w celu ustalenia roli poszczególnych genów w jakimś procesie systematycznie „wyłączają” wszystkie geny po kolei.

Możliwość wykorzystania siRNA zainteresowali się także farmaceuci, gdyż zdolność do specyficznej regulacji funkcjonowania poszczególnych genów stwarza niespotykane dotąd perspektywy w leczeniu wielu chorób. Mały rozmiar i duża specyficzność działania zapewniają wysoką skuteczność i niską toksyczność leków opartych na siRNA; Jednak nie udało się jeszcze rozwiązać problemu dostarczania siRNA do chorych komórek w organizmie - wynika to z kruchości i kruchości tych cząsteczek. I chociaż dziesiątki zespołów próbują obecnie znaleźć sposób na skierowanie tych „magicznych kul” dokładnie w cel (wewnątrz chorych narządów), nie osiągnęły one jeszcze widocznego sukcesu. Poza tym są inne trudności. Przykładowo w przypadku terapii przeciwwirusowej wysoka selektywność działania siRNA może wyrządzić krzywdę – skoro wirusy szybko mutują, zmodyfikowany szczep bardzo szybko straci wrażliwość na wybrany na początku terapii siRNA: wiadomo, że zastąpienie tylko jednego nukleotydu w siRNA prowadzi do znacznego zmniejszenia efektu interferencji.

W tym miejscu warto jeszcze raz przypomnieć – siRNA znaleziono jedynie u roślin, bezkręgowców i organizmów jednokomórkowych; Chociaż homologi białek do interferencji RNA (Dicer, kompleks RISC) są również obecne u zwierząt wyższych, siRNA nie zostały wykryte konwencjonalnymi metodami. Cóż za niespodzianka, gdy sztucznie wprowadzone syntetyczne analogi siRNA wywołały silny, specyficzny, zależny od dawki efekt w hodowlach komórkowych ssaków! Oznaczało to, że w komórkach kręgowców interferencja RNA nie została zastąpiona przez bardziej złożony układ odpornościowy, ale ewoluowała wraz z organizmami, przekształcając się w coś bardziej „zaawansowanego”. W związku z tym u ssaków konieczne było poszukiwanie nie dokładnych analogów siRNA, ale ich ewolucyjnych następców.

Gracz nr 2 – mikroRNA

Rzeczywiście, w oparciu o starożytny ewolucyjnie mechanizm interferencji RNA, bardziej rozwinięte organizmy rozwinęły dwa wyspecjalizowane systemy kontrolowania działania genów, każdy wykorzystujący własną grupę małych RNA - mikroRNA i piRNA (RNA oddziałujący z Piwi). Obydwa systemy pojawiły się w gąbkach i koelenteratach i wraz z nimi ewoluowały, wypierając siRNA i mechanizm interferencji „nagiego” RNA. Ich rola w zapewnianiu odporności maleje, gdyż funkcję tę przejmują bardziej zaawansowane mechanizmy odporności komórkowej, w szczególności układ interferonowy. Jednakże system ten jest na tyle czuły, że uruchamia także sam siRNA: pojawienie się małego dwuniciowego RNA w komórce ssaka wyzwala „sygnał alarmowy” (aktywuje wydzielanie interferonu i powoduje ekspresję genów zależnych od interferonu, co całkowicie blokuje wszystkie procesy tłumaczeniowe). Pod tym względem w mechanizmie interferencji RNA u zwierząt wyższych pośredniczą głównie mikroRNA i piRNA - jednoniciowe cząsteczki o specyficznej strukturze, które nie są wykrywane przez układ interferonu.

W miarę jak genom stawał się coraz bardziej złożony, mikroRNA i piRNA w coraz większym stopniu angażowały się w regulację transkrypcji i translacji. Z biegiem czasu zamieniły się w dodatkowy, precyzyjny i subtelny system regulacji genomu. W przeciwieństwie do siRNA, mikroRNA i piRNA (odkryte w 2001 r., patrz ryc. 3, A-B) nie są wytwarzane z obcych cząsteczek dwuniciowego RNA, ale są początkowo kodowane w genomie organizmu gospodarza.

Prekursor mikroRNA ulega transkrypcji z obu nici genomowego DNA przez polimerazę RNA II, co skutkuje pojawieniem się formy pośredniej – pri-microRNA – noszącej cechy zwykłego mRNA – czapeczki m7G i ogona poliA. Prekursor ten tworzy pętlę z dwoma jednoniciowymi „ogonami” i kilkoma niesparowanymi nukleotydami w środku (ryc. 3A). Taka pętla poddawana jest dwuetapowej obróbce (ryc. B): najpierw endonukleaza Drosha odcina jednoniciowe „ogony” RNA od spinki do włosów, po czym odcięty spinka do włosów (pre-microRNA) jest eksportowana do cytoplazmy, gdzie jest rozpoznawany przez Dicera, który wykonuje jeszcze dwa cięcia (wycinany jest odcinek dwuniciowy, oznaczony kolorami na ryc. 3A). W tej postaci dojrzały mikroRNA, podobnie jak siRNA, wchodzi w skład kompleksu RISC.

Mechanizm działania wielu mikroRNA jest podobny do działania siRNA: krótki (21–25 nukleotydów) jednoniciowy RNA będący częścią kompleksu białkowego RISC wiąże się z dużą swoistością z miejscem komplementarnym w nieulegającym translacji regionie 3' docelowy mRNA. Wiązanie prowadzi do rozszczepienia mRNA przez białko Ago. Jednak aktywność mikroRNA (w porównaniu z siRNA) jest już bardziej zróżnicowana – jeśli komplementarność nie jest absolutna, docelowy mRNA może nie ulec degradacji, a jedynie odwracalnie zablokowany (nie będzie translacji). Ten sam kompleks RISC może również wykorzystywać sztucznie wprowadzone siRNA. To wyjaśnia, dlaczego siRNA utworzone przez analogię z pierwotniakami są również aktywne u ssaków.

Ryż. 3A: Struktura dwuniciowej cząsteczki prekursora mikroRNA
Główne cechy: obecność konserwatywnych sekwencji tworzących spinkę do włosów; obecność kopii komplementarnej (mikroRNA*) z dwoma „dodatkowymi” nukleotydami na końcu 3’; specyficzna sekwencja (2–8 pz), która tworzy miejsce rozpoznawane przez endonukleazy. Sam mikroRNA jest podświetlony na czerwono — to właśnie wycina Dicer.

Ryż. Ryc. 3B: Ogólny mechanizm przetwarzania mikroRNA i realizacja jego działania

Ryż. 3B: Uogólniony schemat działania sztucznych mikroRNA i siRNA
Sztuczne siRNA wprowadza się do komórki za pomocą wyspecjalizowanych plazmidów (wektor ukierunkowany na siRNA).

Funkcje mikroRNA

Ewolucja mikroRNA

Liczba odmian mikroRNA w organizmach wyższych nie została jeszcze w pełni ustalona, według niektórych danych przekracza 1% liczby genów kodujących białka (u człowieka np. mówią, że jest ich 700 i jest to liczba stale rośnie). mikroRNA regulują aktywność około 30% wszystkich genów (dla wielu z nich cele nie są jeszcze znane), a istnieją cząsteczki zarówno wszechobecne, jak i specyficzne tkankowo - na przykład jedna z takich ważnych puli mikroRNA reguluje dojrzewanie pnia krwi komórki.

Ryż. 4. Różnorodność mikroRNA w różnych organizmach
Im wyższa organizacja organizmu, tym więcej znajduje się w nim mikroRNA (liczba w nawiasach). Gatunki, u których znaleziono pojedyncze mikroRNA, zaznaczono na czerwono. Według .

Można wyciągnąć wyraźne powiązanie ewolucyjne pomiędzy siRNA i mikroRNA w oparciu o następujące fakty:

działanie obu typów jest wymienne i pośredniczą w nim białka homologiczne;
siRNA wprowadzone do komórek ssaków specyficznie „wyłączają” pożądane geny (pomimo pewnej aktywacji ochrony interferonem);
MikroRNA odkrywa się w coraz starszych organizmach.

Im bardziej złożony jest genom, tym bardziej rozwinięty i przystosowany jest organizm (lub odwrotnie? ;-). Jednak rosnąca złożoność genomu ma również wadę: złożony system genetyczny staje się niestabilny. Prowadzi to do konieczności istnienia mechanizmów odpowiedzialnych za utrzymanie integralności genomu – w przeciwnym razie spontaniczne „mieszanie” DNA po prostu go unieruchomi. Ruchome elementy genetyczne (MGE), jeden z głównych czynników niestabilności genomu, to krótkie, niestabilne regiony, które mogą ulegać autonomicznej transkrypcji i migrować w całym genomie. Aktywacja takich elementów transpozycyjnych prowadzi do wielokrotnych pęknięć DNA w chromosomach, co może mieć śmiertelne konsekwencje.

„Portret” piRNA

piRNA to krótkie cząsteczki o długości 24–30 nukleotydów, kodowane w regionach centromerowych i telomerowych chromosomu. Sekwencje wielu z nich są komplementarne do znanych ruchomych elementów genetycznych, ale istnieje wiele innych piRNA, które pokrywają się z regionami działających genów lub z fragmentami genomu, których funkcje są nieznane.

piRNA (a także mikroRNA) są kodowane w obu niciach genomowego DNA; są bardzo zmienne i różnorodne (nawet 500 000 (!) gatunków w jednym organizmie). W odróżnieniu od siRNA i mikroRNA składają się one z pojedynczego łańcucha o charakterystycznej cesze – uracylu (U) na końcu 5' i metylowanym końcu 3'. Istnieją inne różnice:

W przeciwieństwie do siRNA i mikroRNA nie wymagają one przetwarzania przez Dicer;
Geny piRNA są aktywne tylko w komórkach rozrodczych (podczas embriogenezy) i otaczających komórkach śródbłonka;
Skład białek układu piRNA jest różny – są to endonukleazy klasy Piwi (Piwi i Aub) oraz osobna odmiana Argonaute – Ago3.

Przetwarzanie i aktywność piRNA są nadal słabo poznane, ale już wiadomo, że mechanizm działania jest zupełnie inny niż w przypadku innych krótkich RNA – dziś zaproponowano ping-pongowy model ich działania (ryc. 5 A, B).

Mechanizm ping-ponga biogenezy piRNA

Ryż. 5A: Cytoplazmatyczna część przetwarzania piRNA
W biogenezie i aktywności piRNA pośredniczy rodzina endonukleaz Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Aktywność piRNA zapewniają zarówno jednoniciowe cząsteczki piRNA – sensowne, jak i antysensowne – z których każda wiąże się ze specyficzną endonukleazą Piwi. piRNA rozpoznaje komplementarny region mRNA transpozonu (niebieska nić) i wycina go. To nie tylko inaktywuje transpozon, ale także tworzy nowy piRNA (połączony z Ago3 poprzez metylację końca 3' przez metylazę Hen1). Ten piRNA z kolei rozpoznaje mRNA z transkryptami z klastra prekursorowego piRNA (nić czerwona) – w ten sposób cykl zostaje zamknięty i ponownie wytwarzany jest pożądany piRNA.

Ryż. 5B: piRNA w jądrze
Oprócz endonukleazy Aub, endonukleaza Piwi może również wiązać antysensowny piRNA. Po związaniu kompleks migruje do jądra, gdzie powoduje degradację komplementarnych transkryptów i przegrupowanie chromatyny, powodując supresję aktywności transpozonów.

Funkcje piRNA

Dystrybucja i ewolucja piRNA

U zwierząt wyższych, w tym u ludzi, system piRNA jest bardzo dobrze rozwinięty, ale można go znaleźć tylko w komórkach embrionalnych i śródbłonku owodniowym. Czas pokaże, dlaczego dystrybucja piRNA w organizmie jest tak ograniczona. Można założyć, że jak każda potężna broń, piRNA przynoszą korzyść tylko w bardzo specyficznych warunkach (podczas rozwoju płodu), a w dorosłym organizmie ich działanie przyniesie więcej szkody niż pożytku. Mimo to liczba piRNA przewyższa liczbę znanych białek o rząd wielkości, a niespecyficzne działanie piRNA w dojrzałych komórkach jest trudne do przewidzenia.

Stół obrotowy. Właściwości wszystkich trzech klas krótkich RNA

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Rozpościerający się	Rośliny, Drosophila, C. elegancja. Nie występuje u kręgowców	Eukarionty	Komórki embrionalne zwierząt (począwszy od koelenteratów). Nie u pierwotniaków i roślin
Długość	21-22 nukleotydów	19-25 nukleotydów	24-30 nukleotydów
Struktura	Dwuniciowy, 19 komplementarnych nukleotydów i dwa niesparowane nukleotydy na końcu 3’	Jednołańcuchowa złożona struktura	Jednołańcuchowa złożona struktura. U na końcu 5', 2'- O-metylowany koniec 3'
Przetwarzanie	Zależne od Dicera	Zależne od Dicera	Niezależny od Dicera
Endonukleazy	temu2	temu1, temu2	temu3, Piwi, Aub
Działalność	Degradacja komplementarnych mRNA, acetylacja genomowego DNA	Degradacja lub hamowanie translacji docelowego mRNA	Degradacja mRNA kodującego MGE, regulacja transkrypcji MGE
Rola biologiczna	Przeciwwirusowa obrona immunologiczna, tłumienie aktywności własnych genów	Regulacja aktywności genów	Tłumienie aktywności MGE podczas embriogenezy

Wniosek

Podsumowując, chciałbym przedstawić tabelę ilustrującą ewolucję aparatu białkowego biorącego udział w interferencji RNA (ryc. 6). Można zauważyć, że pierwotniaki mają najbardziej rozwinięty system siRNA (rodziny białek Ago, Dicer), a w miarę jak organizmy stają się bardziej złożone, nacisk przesuwa się na układy bardziej wyspecjalizowane – liczbę izoform białek dla mikroRNA (Drosha, Pasha) i piRNA ( Piwi, Hen1) wzrasta. Jednocześnie zmniejsza się różnorodność enzymów pośredniczących w działaniu siRNA.

Ryż. 6. Różnorodność białek biorących udział w interferencji RNA I
Liczby wskazują liczbę białek w każdej grupie. Elementy charakterystyczne dla siRNA i mikroRNA zaznaczono na niebiesko, a białka związane z piRNA na czerwono. Według .

Zjawisko interferencji RNA zaczęły wykorzystywać najprostsze organizmy. W oparciu o ten mechanizm natura stworzyła prototyp układu odpornościowego, a w miarę jak organizmy stają się coraz bardziej złożone, interferencja RNA staje się niezbędnym regulatorem aktywności genomu. Dwa różne mechanizmy plus trzy typy krótkich RNA (patrz tabela podsumowująca) – w rezultacie widzimy tysiące drobnych regulatorów różnych szlaków metabolicznych i genetycznych. Ten uderzający obraz ilustruje wszechstronność i ewolucyjną adaptację systemów biologii molekularnej. Krótkie RNA po raz kolejny udowadniają, że we wnętrzu komórki nie ma „małych rzeczy” – są jedynie małe cząsteczki, których pełne znaczenie dopiero zaczynamy rozumieć.

To prawda, że tak fantastyczna złożoność sugeruje raczej, że ewolucja jest „ślepa” i działa bez z góry zatwierdzonego „głównego planu”.

Literatura

Gurdon J. B., Lane CD, Woodland HR, Marbaix G. (1971). Zastosowanie żabich jaj i oocytów do badania informacyjnego RNA i jego translacji w żywych komórkach. Natura 233, 177-182;
Spirin AS (2001). Biosynteza białek, świat RNA i pochodzenie życia. Biuletyn Rosyjskiej Akademii Nauk 71, 320-328;
Elementy: „Z sierści można teraz wyodrębnić kompletne genomy mitochondrialne wymarłych zwierząt”;
Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Silna i specyficzna interferencja genetyczna ze strony dwuniciowego RNA Caenorhabditis eleganckie. Natura 391, 806-311;
Biomolekuła: „MikroRNA odkryte po raz pierwszy w organizmie jednokomórkowym”;
Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Rośliny zwalczają infekcję poprzez wyciszanie genów. Natura 385, 781-782;
Biomolekuła: „Podwójne działanie molekularne: ludzkie geny działają na rzecz wirusa grypy”;
Ren B. (2010). Transkrypcja: Wzmacniacze tworzą niekodujący RNA. Natura 465, 173–174;
Taganov K.D., Boldin MP, Chang K.J., Baltimore D. (2006). Zależna od NF-κB indukcja mikroRNA miR-146, inhibitora ukierunkowanego na białka sygnalizacyjne wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA. 103, 12481-12486;
O'Connell R. M., Rao D. S., Chaudhuri A. A., Boldin MP, Taganov K. D., Nicoll J., Paquette R. L., Baltimore D. (2008). Długotrwała ekspresja mikroRNA-155 w hematopoetycznych komórkach macierzystych powoduje zaburzenie mieloproliferacyjne. J. Exp. Med. 205, 585-594;
Biomolekuła: „mikroRNA – im dalej w las, tym więcej drewna na opał”;
Elementy: „Powikłania w organizmie starożytnych zwierząt wiązały się z pojawieniem się nowych cząsteczek regulacyjnych”;
Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Wczesne pochodzenie i ewolucja mikroRNA i RNA oddziałujących z Piwi u zwierząt. Natura 455, 1193–1197.
Aravin A., Hannon G., Brennecke J. (2007). Ścieżka Piwi-piRNA zapewnia obronę adaptacyjną w wyścigu zbrojeń transpozonowych. Nauka 318, 761–764;
Biocząsteczka: "