Enteropatie noworodków, objawy, leczenie. Niedobory odporności spowodowane upośledzoną odpornością komórkową

Zespół IPEX to zespół zaburzeń układu odpornościowego, poliendokrynopatii i enteropatii z dziedziczeniem recesywnym sprzężonym z chromosomem X (immunodysregiilacja, poliendokrynopatia i enteropatia, sprzężone z chromosomem X).

Objawy: Poliendokrynopatia (zaburzenie układu gruczołów dokrewnych), objawiająca się rozwojem cukrzycy typu 1. W tego typu cukrzycy komórki układu odpornościowego atakują i niszczą komórki trzustki wytwarzające insulinę – hormon biorący udział w metabolizmie glukozy (cukru) w organizmie. Pacjenci z IPEX nie wytwarzają insuliny i rozwija się stan hiperglikemii – wysoki poziom cukru we krwi. Możliwe jest również rozwinięcie się autoimmunologicznego zapalenia tarczycy – zapalenia tarczycy spowodowanego własnym atakiem układ odpornościowy, tarczyca nie może już prawidłowo wykonywać swoich funkcji (na przykład zaburzony jest metabolizm wapnia w organizmie). Enteropatia (uszkodzenie przewodu żołądkowo-jelitowego) objawia się uporczywą biegunką, która rozpoczyna się przed lub w trakcie jedzenia, możliwe jest krwawienie z jelit. Niedokrwistość hemolityczna - hemoliza (zniszczenie) czerwonych krwinek i zmniejszenie ilości hemoglobiny. Wysypki skórne typu wyprysk (wysypka skórna z towarzyszącym swędzeniem i łuszczeniem). Zapalenie stawów (zapalenie stawów), powiększenie węzłów chłonnych (powiększone i bolesne węzły chłonne), uszkodzenie nerek. Kacheksja (ekstremalne wyniszczenie). Zwiększona podatność na infekcje ze względu na obecność rozregulowania układu odpornościowego (upośledzone oddziaływanie komórek układu odpornościowego między sobą i z innymi komórkami) i/lub neutropenię (zmniejszenie liczby neutrofili – komórek układu odpornościowego, których główną funkcją jest ochrona przed infekcjami): zapalenie płuc (zapalenie płuc), zapalenie otrzewnej ( ropne zapalenie otrzewnej), posocznica (zakażenie krwi), septyczne zapalenie stawów (ropne zapalenie stawów).

Zespół IPEX jest powiązany z mutacjami w genie FOXP3

Metoda badawcza: Sekwencjonowanie genu FOXP3

zespół białkowy), zabawa ważna rola w funkcjonowaniu cytoszkieletu. Reguluje polimeryzację aktyny. Normalna funkcja Białko to jest niezbędne do pełnej ruchliwości komórek, ich polaryzacji, tworzenia filopodiów podczas chemotaksji, adhezji komórek i tworzenia synapsy odpornościowej podczas interakcji komórek układu odpornościowego.

W zależności od lokalizacji mutacji i długości dotkniętego regionu genu rozwijają się trzy typy: wariant kliniczny choroby: pełnoobjawowy zespół Wiskotta-Aldricha (konsekwencja delecji) i warianty z izolowana manifestacja małopłytkowość lub neutropenia. Klasyczny obraz zespołu Wiskotta-Aldricha charakteryzuje się małopłytkowością z małymi płytkami krwi, egzemą i nawracającymi infekcjami.

Zespół Wiskotta-Aldricha charakteryzuje się wieloma zaburzeniami układu odpornościowego, wpływającymi głównie na aktywność fagocytarną i cytolityczną komórek odporność wrodzona, tj. funkcje, które są najbardziej zależne od ruchu komórek i aktywnego udziału cytoszkieletu. Zakłócenie tworzenia synapsy odpornościowej między limfocytami T i APC wpływa na wszystkie przejawy odporności nabytej.

Ataksja-teleangiektazja (zespół Louisa-Bara)

Choroba dziedziczna spowodowana defektem genu ATM (zmutowana ataksja-teleangiektazja). Odnosi się do chorób opartych na zespole rozpadu chromosomów. Choroba rozwija się w wyniku mutacji zachodzących w dowolnej części genu ATM. Skutkiem mutacji może być całkowity brak lub osłabienie syntezy białka ATM, a także synteza funkcjonalnie wadliwego białka.

Białko ATM jest kinazą białkową serynowo-treoninową. Jego główną funkcją jest inicjowanie sygnałów naprawczych dla pęknięć dwuniciowego DNA, które powstają zarówno w warunkach fizjologicznych (podczas mejozy, rearanżacji genów V receptorów rozpoznających antygen itp.), jak i indukowanych czynnikami zewnętrznymi (np. promieniowaniem jonizującym). Kiedy dochodzi do pęknięć DNA, kinaza ATM ulega autofosforylacji i zmienia się z formy dimerycznej w monomeryczną. Kinaza ATM zapewnia fosforylację białek kompleksu MRN i związanych z nim czynników, które bezpośrednio dokonują naprawy DNA. W przypadku niewielkiej ilości pęknięć z powodzeniem pełnią tę funkcję. Jeśli skuteczna naprawa nie jest możliwa, rozwija się apoptoza, wyzwalana przez czynnik p53. Brak całkowitej naprawy DNA powoduje niestabilność genomu, co skutkuje wzrostem radiowrażliwości komórek i częstością rozwoju nowotworów złośliwych, zwłaszcza chłoniaków i białaczek.

Najbardziej charakterystycznym objawem klinicznym ataksji-teleangiektazji jest nasilająca się ataksja, objawiająca się zmianami w chodzie. Jest to spowodowane neurodegeneracją z zanikiem móżdżku. Rozwój procesów neurodegeneracyjnych wiąże się z faktem, że w okresie dojrzewania neuronów mózgowych zachodzą procesy rekombinacji DNA, którym towarzyszą podwójne pęknięcia. Innym objawem, od którego wzięła się nazwa choroby, jest teleangiektazja, czyli utrzymujące się rozszerzenie naczyń krwionośnych oczu i twarzy.

Upośledzona naprawa pęknięć DNA, które występują podczas dojrzewania limfocytów T i B, jest również przyczyną niedoboru odporności obserwowanego w ataksji-teleangiektazji. Niedobory odporności objawiają się przewlekłymi, nawracającymi bakteryjnymi i wirusowymi chorobami zakaźnymi aparatu oskrzelowo-płucnego, które zwykle powodują śmierć pacjenta.

Zespół Nijmegena

Nijmegen to miasto w Holandii, w którym po raz pierwszy opisano ten zespół. Ten Dziedziczna choroba zaliczane są do zespołów rozpadu chromosomów, którym towarzyszy powstawanie niestabilności genomu. Rozwój tej choroby związany jest z mutacją w genie NBS1, którego produkt – nibryna – bierze udział w naprawie DNA w ramach kompleksu MRN, będącego substratem fosforylacji przez kinazę białkową ATM. Pod tym względem zarówno patogeneza, jak i objawy kliniczne zespołu Nijmegena praktycznie pokrywają się z ataksją-teleangiektazją. W obu przypadkach rozwijają się zmiany neurodegeneracyjne, jednak w zespole Nijmegen dominuje zjawisko małogłowia, gdyż procesy rekombinacji DNA zachodzą także podczas dojrzewania neuronów mózgowych.

Autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny

Choroba charakteryzuje się upośledzoną apoptozą i związaną z nią niezłośliwą limfoproliferacją, hiperimmunoglobulinemią, procesami autoimmunologicznymi oraz wzrostem zawartości komórek CD3+ CD4-CD8- we krwi. Mutacje leżące u podstaw zespołu są najczęściej zlokalizowane w genie TFRRSF6, który koduje receptor Fas (CD95). Jedynie mutacje prowadzą do objawów klinicznych powodując zmianę w obszarze wewnątrzkomórkowym cząsteczki CD95. Rzadziej mutacje wpływają na geny ligandu Fas oraz kaspazy 8 i 10 (patrz sekcja 3.4.1.5). Mutacje objawiają się osłabieniem ekspresji cząsteczek kodowanych przez odpowiedni gen oraz osłabieniem lub całkowitym brakiem przekazywania sygnału apoptotycznego.

Zespół limfoproliferacyjny sprzężony z chromosomem X

Rzadki niedobór odporności charakteryzujący się wypaczoną odpowiedzią przeciwwirusową, przeciwnowotworową i immunologiczną. Czynnikiem sprawczym zespołu limfoproliferacyjnego sprzężonego z chromosomem X jest wirus Epsteina-Barra. Wirus przedostaje się do limfocytów B poprzez interakcję cząsteczki gp150 otoczki wirusa z receptorem CD21 na Błona komórkowa. U pacjentów z zespołem limfoproliferacyjnym sprzężonym z chromosomem X następuje poliklonalna aktywacja limfocytów B i następuje niezakłócona replikacja wirusa.

Zakażenie wirusem Epsteina-Barra w zespole limfoproliferacyjnym sprzężonym z chromosomem X jest wynikiem mutacji w genie SH2D1A, kodującym białko adaptorowe SAP [ Białko związane z cząsteczką sygnalizacyjną aktywacji limfocytów (SLAM).] Domena SH2 białka SAP rozpoznaje motyw tyrozyny w cytoplazmatycznej części SLAM i szeregu innych cząsteczek. Procesy zachodzące w komórkach układu odpornościowego po aktywacji za pośrednictwem receptora SLAM odgrywają wiodącą rolę w odporności przeciwwirusowej. Receptor SLAM ulega ekspresji na tymocytach, komórkach dendrytycznych T i B oraz makrofagach. Ekspresja wzrasta, gdy komórki są aktywowane. Regulacyjne działanie białka SAP wiąże się z hamowaniem aktywności fosfatazy tyrozynowej

4.7. Niedobory odporności

w sprawie SLAM-u. W przypadku braku SAP, fosfataza SH-2 wiąże się swobodnie z receptorem SLAM, defosforyluje go i hamuje przekazywanie sygnału. Główne efektory obrony przeciwwirusowej, komórki T i NK, nie ulegają aktywacji, co prowadzi do niekontrolowanej proliferacji wirusa Epsteina-Barra. Dodatkowo SAP ułatwia interakcję kinazy tyrozynowej Fyn z receptorem SLAM, co sprzyja przekazywaniu sygnału aktywacyjnego.

Wśród różnorodnych objawów klinicznych zespołu limfoproliferacyjnego sprzężonego z chromosomem X najbardziej spójne są piorunująca mononukleoza zakaźna, łagodne i złośliwe choroby limfoproliferacyjne oraz dysgammaglobulinemia lub hipogammaglobulinemia. Wśród zmian miejscowych dominuje uszkodzenie wątroby, spowodowane naciekiem limfocytów B zakażonych wirusem Epsteina-Barra i aktywowanych limfocytów T, co prowadzi do martwicy tkanki wątroby. Niewydolność wątroby jest jedną z głównych przyczyn zgonów pacjentów z zespołem limfoproliferacyjnym sprzężonym z chromosomem X.

Zespół IPEX

Zespół zaburzeń immunologicznych sprzężony z chromosomem X, poliendokrynopatia i enteropatia ( Rozregulowanie układu odpornościowego, poliendokrynopatia, enteropatia zespół sprzężony z chromosomem X) rozwija się w wyniku mutacji w genie FOXP3, zlokalizowanym na chromosomie X. FOXP3 jest „genem głównym” odpowiedzialnym za rozwój regulatorowych limfocytów T o fenotypie CD4+ CD25+. Te komórki grają centralną rolę w hamowaniu aktywności autospecyficznych klonów limfocytów T na obwodzie. Defekt w genie FOXP3 jest związany z brakiem lub niedoborem tych komórek i odhamowaniem różnych procesów autoimmunologicznych i alergicznych.

Zespół IPEX objawia się rozwojem licznych zmian autoimmunologicznych narządy endokrynologiczne, przewodu pokarmowego i układu rozrodczego. Ta choroba zaczyna się w młodym wieku i charakteryzuje się uszkodzeniem wielu narządów wydzielania wewnętrznego ( cukrzyca typu I, zapalenie tarczycy) z wysokim poziomem autoprzeciwciał, ciężką enteropatią, kacheksją, niskim wzrostem, objawami alergicznymi (egzema, alergia pokarmowa, eozynofilia, wzrost Poziom IgE), a także zmiany hematologiczne ( niedokrwistość hemolityczna, trombocytopenia). Chore dzieci (chłopcy) umierają w pierwszym roku życia z powodu powtarzających się ciężkich chorób zakaźnych.

Zespół APECED

Autoimmunologiczna poliendokrynopatia, kandydoza, dystrofia ektodermalna ( Autoimmunologiczna poliendokrynopatia, kandydoza, dystrofia ektodermalna) to zespół autoimmunologiczny spowodowany defektem negatywnej selekcji tymocytów. Jego przyczyną są mutacje genu AIRE, odpowiedzialnego za ektopową ekspresję białek narządowo-specyficznych w komórkach nabłonkowych i dendrytycznych rdzenia grasicy, odpowiedzialnego za selekcję negatywną (patrz rozdział 3.2.3.4). Proces autoimmunologiczny wpływa głównie przytarczyc i nadnercza, a także wyspy trzustki (rozwija się cukrzyca typu I), tarczyca i narządy płciowe.

Często towarzyszy rozwojowi kandydozy. Identyfikuje się także defekty w morfogenezie pochodnych ektodermy.

Rozpatrując spektrum pierwotnych niedoborów odporności, zwraca się uwagę na brak jednostek nozologicznych związanych z patologią komórek NK. Do chwili obecnej opisano kilkanaście mutacji wpływających na funkcję tych komórek u poszczególnych osób, co sugeruje, że niedobory odporności selektywnie wpływające na komórki NK są niezwykle rzadkie.

4.7.2. Zakażenie wirusem HIV i zespół nabytego niedoboru odporności

Oprócz pierwotnych niedoborów odporności jedyną chorobą, w przypadku której uszkodzenie układu odpornościowego jest podstawą patogenezy i determinuje objawy, jest zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS; Zespół nabytego niedoboru odporności- AIDS). Tylko ona może zostać uznana za niezależną nabytą chorobę niedoboru odporności.

Historia odkrycia AIDS sięga 1981 roku, kiedy to Centrum Kontroli Chorób (USA, Atlanta) opublikowało raport grup lekarzy z Nowego Jorku i Los Angeles na temat niezwykłej choroby zarejestrowanej u mężczyzn homoseksualnych. Charakteryzowała się ciężką postacią zapalenia płuc wywołanego przez oportunistycznego grzyba Pneumocystis carinii. Kolejne doniesienia dostarczyły danych na temat poszerzenia grupy pacjentów i dostarczyły danych na temat występowania niedoborów odporności z nimi związanych Gwałtowny spadek zawartość w krążeniu limfocytów T CD4+, któremu towarzyszy rozwój procesów zakaźnych, które mogą być spowodowane, oprócz pneumocystozy, przez inne fakultatywne patogeny. U niektórych chorych rozwinął się mięsak Kaposiego, który charakteryzował się nietypowym dla tej choroby agresywnym przebiegiem. Do czasu publikacji tych materiałów 40% zidentyfikowanych pacjentów zmarło. Później okazało się, że epidemia choroby opanowała już Afrykę Równikową, gdzie choroba rozprzestrzenia się głównie poprzez heteroseksualne kontakty seksualne. Międzynarodowa społeczność medyczna nie tylko uznała istnienie nowej formy nozologicznej - „zespołu nabytego niedoboru odporności” ( Zespół nabytego niedoboru odporności), Ale

I ogłosił początek pandemii tej choroby. Tak dramatyczny debiut AIDS przyciągnął powszechną uwagę, wykraczającą daleko poza środowisko zawodowe. W naukach medycznych, zwłaszcza w immunologii, problem AIDS znacząco wpłynął na rozkład wysiłków i finansów w rozwoju badania naukowe. Po raz pierwszy choroba związana z dominującym uszkodzeniem układu odpornościowego okazała się tak istotna pod względem naukowym i społecznym.

DO data z początku 2007 roku Zakażonych wirusem HIV było 43 miliony, z czego 25 milionów zmarło, roczny wzrost tej liczby wynosi 5 milionów, a roczna śmiertelność wynosi 3 miliony.60% zakażonych żyje w Afryce Subsaharyjskiej.

W 1983 roku niemal jednocześnie we Francji [L. Montagnier (L. Montagnier)]

I Stany Zjednoczone Ameryki [R.S. Gallo ( RC Gallo)] została ustalona

4.7. Niedobory odporności

wirusowy charakter AIDS i jego czynnika sprawczego, HIV (ludzki wirus niedoboru odporności, Ludzki wirus niedoboru odporności - HIV). Należy do retrowirusów, tj. wirusy, w których RNA służy jako nośnik informacji dziedzicznej i jest odczytywany przy udziale odwrotnej transkryptazy. Wirus ten należy do podrodziny lentiwirusów – wirusów wolno działających wywołujące choroby z długim okresem inkubacji. Rodzaj HIV obejmuje gatunek HIV-1, który jest czynnikiem sprawczym typowy kształt AIDS i HIV-2, który różni się od HIV-1 szczegółami budowy i działania chorobotwórczego, ale ogólnie jest do niego podobny. HIV-2 powoduje łagodniejszą odmianę choroby, występującą głównie w Afryce. Poniższe informacje dotyczą przede wszystkim wirusa HIV-1 (o ile nie zaznaczono inaczej). Wyróżnia się 3 grupy wirusów HIV – M, O i N, podzielone na 34 podtypy.

Obecny pogląd jest taki, że HIV-1 pochodzi od wirusa szympansa Afryka Zachodnia(najprawdopodobniej w Kamerunie, kraju, w którym HIV jest chorobą endemiczną) około lat 30. XX wieku. HIV-2 pochodzi z małpiego wirusa SIVsm. Warianty wirusa HIV-1 są nierównomiernie rozmieszczone na całym świecie. W kraje rozwinięte Na Zachodzie dominuje podtyp B, w Europie Środkowej i Rosji - podtypy A, B i ich rekombinanty. Inne warianty dominują w Afryce i Azji, a wszystkie znane podtypy HIV występują w Kamerunie.

Morfologia, geny i białka ludzkiego wirusa niedoboru odporności

Strukturę wirusa HIV pokazano na ryc. 4,46. Wirus ma średnicę około 100 nm. Jest otoczony muszlą, z której ma kształt grzyba

Powłoka

Białka i enzymy nukleokapsydów

Nukleokapsyd

Ryż. 4,46. Schemat struktury ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 (HIV-1)

Rozdział 4. Immunitet w ochronie i niszczeniu ciała...

Ryż. 4,47. Struktura genomu ludzkiego wirusa niedoboru odporności 1 (HIV-1). Wskazano lokalizację genów na dwóch cząsteczkach RNA wirusa

kolce, których zewnętrzna część jest utworzona przez białko otoczki gp120, a części przylegające do błony i przezbłonowe są utworzone przez białko gp41. Kolce reprezentują trimery tych cząsteczek. Białka te biorą udział w interakcji wirusa z komórką gospodarza, a odpowiedź immunologiczna tej ostatniej jest skierowana głównie przeciwko nim. Głębiej znajduje się warstwa matrycy, która pełni rolę ramki. Środkową część wirusa tworzy kapsyd w kształcie stożka, który zawiera genomowy RNA. Zlokalizowane są tu także nukleoproteiny i enzymy: odwrotna transkryptaza (p66/p51), integraza (p31–32), proteaza (p10) i RNaza (p15).

Strukturę genetyczną wirusa HIV oraz białka kodowane przez jego geny przedstawiono na ryc. 4,47. W dwóch cząsteczkach jednoniciowego RNA o łącznej długości 9,2 kb zlokalizowanych jest 9 genów kodujących 15 białek HIV. Sekwencje kodujące struktury wirusa są ograniczone na końcach 5' i 3' długimi powtórzeniami końcowymi (LTR - Long terminal Repeats), które pełnią funkcje regulacyjne. Geny strukturalne i regulacyjne częściowo się pokrywają. Główne geny strukturalne to 3 - gag, pol i env. Gen gag warunkuje powstawanie specyficznych dla grupy antygenów rdzenia – nukleoidu i macierzy. Gen pol koduje polimerazę DNA (odwrotną transkryptazę) i inne białka nukleotydowe. Gen env koduje tworzenie wspomnianych powyżej białek otoczki. We wszystkich przypadkach przetwarzany jest pierwotny produkt genu, tj. rozkłada się na mniejsze białka. Geny regulatorowe zlokalizowane są pomiędzy genami pol i env (geny vif, vpr, vpu, vpx, rev, tat) i dodatkowo zajmują 3'-końcową część genomu (fragmenty genów tat i rev, gen nef ). Białka kodowane przez geny regulatorowe są ważne dla tworzenia wirionu i jego związku z komórką. Spośród nich najważniejszymi białkami są tat, transaktywator transkrypcji i nef (27 kDa), jego negatywny regulator. Wadliwe białko nef wykrywa się w „długich wątrobach” zakażonych wirusem HIV, u których nie dochodzi do progresji choroby.

Najważniejsze dla immunologii zakażenia wirusem HIV, diagnostyki i rozwoju podejść do immunoterapii AIDS są białka otoczki gp120 i gp41. Gen env jest powiązany z niezwykle dużą zmiennością wirusa HIV. Gen zawiera 5 regionów stałych (C) i pięć regionów zmiennych (V); w tym ostatnim przypadku sekwencja aminokwasów różni się w zależności od izolatu wirusa o 30–90%. Pętla zmienna V3 jest szczególnie ważna dla immunogenności. Częstotliwość mutacji w genie env wynosi 10-4-10-5 zdarzeń na genom na cykl, tj. 2–3 rzędy wielkości wyższe niż normalna częstotliwość mutacji genów. Znaczną część cząsteczki zajmują reszty węglowodanowe.

4.7. Niedobory odporności

Zakażenie komórek ludzkim wirusem niedoboru odporności

Proces zakażenia komórek ludzkich wirusem HIV i jego późniejsza replikacja składa się z kilku etapów. We wczesnej fazie koło życia Można wyróżnić następujące fazy:

– wiązanie wirusa HIV z powierzchnią komórki (odbiór);

– fuzja błon wirusa i komórki oraz przenikanie wirusa do komórki (fuzja i „rozbieranie się”);

– początek odwrotnej transkrypcji; tworzenie kompleksu przedintegracyjnego;

– transport kompleksu preintegracyjnego do nukleoplazmy;

– integracja prowirusa z genomem komórki.

DO Etapy późnej fazy cyklu życiowego wirusa HIV obejmują:

– transkrypcja wirusowego RNA na matrycy zintegrowanego prowirusowego DNA;

– eksport wirusowego RNA do cytozolu;

– translacja wirusowego RNA, obróbka białek;

– montaż cząsteczki wirusa na błonie komórkowej;

– uwolnienie nowo powstałego wirionu.

Głównymi punktami wejścia infekcji są błony śluzowe dróg moczowo-płciowych i przewodu pokarmowego. Wnikanie wirusa do organizmu jest znacznie ułatwione w przypadku uszkodzenia błony śluzowej, ale infekcja jest możliwa nawet przy ich braku. W tym przypadku wirus jest wychwytywany przez procesy komórek dendrytycznych, które przenikają do światła narządu. W każdym razie komórki dendrytyczne jako pierwsze wchodzą w interakcję z wirusem HIV. Transportują wirusa do regionalnych węzłów chłonnych, gdzie infekuje on limfocyty T CD4+ poprzez interakcję komórek dendrytycznych z limfocytami T podczas prezentacji antygenów.

Przyjęcie wirusa HIV następuje w wyniku wzajemnego rozpoznania trimeru białka gp120 wirusa i glikoproteiny błonowej CD4 komórki gospodarza. Regiony odpowiedzialne za ich oddziaływanie zlokalizowane są na obu cząsteczkach. Na cząsteczce gp120 wskazany region znajduje się w jej części C-końcowej (reszty 420–469), dodatkowo znajdują się jeszcze 3 regiony ważne dla utworzenia miejsca interakcji z CD4 oraz region (254–274) odpowiedzialny za wnikanie wirusa do komórki po związaniu się z błoną CD4. Na cząsteczce CD4 miejsce wiązania gp120 znajduje się w N-końcowej domenie V (D1) i obejmuje sekwencje reszt 31–57 i 81–94.

Ponieważ cząsteczka CD4 służy jako receptor dla HIV, zakres komórek docelowych tego wirusa jest określony przez jego ekspresję (Tabela 4.20). Naturalnie jego głównymi celami są limfocyty T CD4+, a także niedojrzałe tymocyty wykazujące ekspresję obu koreceptorów (CD4 i CD8). Komórki dendrytyczne i makrofagi wykazujące słabą ekspresję CD4 na błonie są również skutecznie zakażane wirusem i służą jako jego aktywni producenci (replikacja wirusa HIV w komórkach dendrytycznych jest jeszcze większa niż w limfocytach T). Przynajmniej inne komórki, które zawierają na powierzchni małe ilości CD4 - eozynofile, megakariocyty, komórki śródbłonka, niektóre komórki nabłonkowe (nabłonek grasicy, komórki M jelit) i komórki nerwowe (neurony, komórki mikrogleju, astrocyty, oligodendrocyty), plemniki, komórki kosmówkowo-moczniowe, mięśnie prążkowane.

680 Rozdział 4. Immunitet w ochronie i niszczeniu ciała...

Tabela 4.20. Stan parametrów immunologicznych w zespole nabytego niedoboru odporności

Indeks	Przedkliniczne	Etap kliniczny
		manifestacje
Liczba limfocytów
	Normalny lub zmniejszony	Mniej niż 200 komórek na
		1 µl krwi
	Normalny lub zwiększony	Normalny lub zmniejszony
		(może być procent
Stosunek CD4+/CD8+
Stosunek Th1/Th2	Normalny lub zmniejszony
Działanie cytotoksyczne	Lansowany
limfocyty T
Odpowiedź komórek T	Normalny lub zmniejszony	Mocno przygnębiony
do mitogenów
	Normalny lub zmniejszony
Antygenemia	Pojawia się	Nieobecny
	2–8 tygodni
Przeciwciała w krążeniu	Zwykle pojawiają się po	Obecny
Czynniki rozpuszczalne w	Rozpuszczalne formy łańcucha α IL-2R, CD8, TNFR,
krążenie	β2-mikroglobulina, neopteryna
		Funkcja zredukowana
Tkanki limfatyczne, zespo-	Wczesny spadek zawartości	Silne tłumienie
pokryte śluzem	Redukcja limfocytów T CD4+	Limfocyty T, zwłaszcza podzbiory
grube skorupy		Populacje CD4+
Odporność wrodzona	Normalny lub przygnębiony	Przygnębiony

Dodatkowymi cząsteczkami niezbędnymi do wniknięcia wirusa HIV do komórek są jego koreceptory - 2 receptory chemokin: CXCR4 (receptor dla chemokin CXCL12) i CCR5 (receptor dla chemokin CCL4 i CCL5). W mniejszym stopniu koreceptor jest nieodłącznie związany z kilkunastu receptorami chemokin. CXCR4 pełni funkcję koreceptora dla szczepów HIV-1 hodowanych na liniach komórek T, a CCR5 dla szczepów hodowanych na liniach makrofagów (jest obecny na makrofagach, komórkach dendrytycznych, a także na limfocytach T CD4+). Obydwa te receptory są klasyfikowane jako rodopsynopodobne i przekazują sygnał do komórki poprzez powiązane z nimi białko G (patrz sekcja 4.1.1.2). Obydwa chemoreceptory oddziałują na siebie

Z białko gp120; miejsce wiązania tych receptorów otwiera się w cząsteczce gp120 po interakcji z CD4 (ryc. 4.48). Różne izolaty wirusa HIV różnią się pod względem selektywności w stosunku do niektórych koreceptorów. Wspomagająca rola w recepcji HIV-2 odgrywają cząsteczki adhezyjne, w szczególności LFA-1. Kiedy komórki dendrytyczne są zakażone w interakcji

Z Zaangażowany receptor lektyny HIV ZNAK DC.

4.7. Niedobory odporności

Regiony hiperzmienne gp120

Ryż. 4,48. Schemat interakcji wirusa z komórką docelową podczas jej infekcji. Zilustrowano jedną z opcji interakcji cząsteczek receptora komórek T i cząsteczek HIV-1, zapewniając przenikanie wirusa do komórki

Koreceptory odgrywają ważną rolę w fuzji otoczki wirusa z błoną komórkową. Od strony wirusa główna rola Białko gp41 odgrywa rolę w fuzji. Po fazach fuzji (fuzji) i „rozbierania” wirusa tworzy się odwrotny kompleks, który zapewnia odwrotną transkrypcję z utworzeniem dwuniciowego prowirusowego DNA.

Używając enzym wirusowy cDNA integrazy integruje się z DNA komórki, tworząc prowirus. Osobliwością integracji genów HIV z genomem komórkowym jest to, że nie wymaga ona podziału komórki. W wyniku integracji powstaje utajona infekcja, w której zazwyczaj biorą udział limfocyty T pamięci, czyli „uśpione” makrofagi, które stanowią rezerwę infekcji.

Replikacja wirusa HIV zachodzi głównie lub wyłącznie w aktywowanych komórkach. Kiedy limfocyty T CD4+ ulegają aktywacji, indukowany jest czynnik transkrypcyjny NF-KB, który wiąże się z promotorami zarówno komórkowego, jak i wirusowego DNA. Komórkowa polimeraza RNA transkrybuje wirusowe RNA. Geny tat i rev ulegają transkrypcji wcześniej niż inne, których produkty biorą udział w replikacji wirusa.Tat to białko oddziałujące z długimi sekwencjami końcowymi (LTR), co gwałtownie zwiększa tempo transkrypcji wirusa. Rev jest białkiem, które promuje wyjście wirusowych transkryptów mRNA, zarówno złożonych, jak i nieskręconych, z jądra. Wirusowy mRNA uwolniony z jądra służy jako matryca do syntezy białek strukturalnych i regulatorowych. Białka strukturalne gag, env, pol tworzą cząsteczkę wirusa, która wyrasta z komórki.

Stymulacja limfocytów mitogenami nasila replikację wirusa HIV i jego działanie cytopatogenne. Mogą temu sprzyjać czynniki endogenne towarzyszące aktywacji komórek, indukowane w aktywowanych limfocytach i makrofagach (wspomniano już o NF-κB). Cytokiny, zwłaszcza TNFα i IL-6, również mogą być takimi czynnikami. Pierwszy aktywuje transkrypcję genów HIV, drugi stymuluje ekspresję wirusa HIV w komórkach gospodarza. Podobny efekt mają czynniki stymulujące kolonię GM-CSF i G-CSF. IL-1, IL-2, IL-3 i IFNγ mogą działać jako kofaktory aktywacji HIV. Hormony glukokortykoidowe nadnerczy przyczyniają się do realizacji programu genetycznego wirusa HIV. IL-4, IL-7 i IFNα mają przeciwne skutki.

Odpowiedź immunologiczna na antygeny HIV

Ostra infekcja wirusowa charakteryzuje się stosunkowo szybkim tworzeniem się limfocytów T CD4+ i CD8+ specyficznych dla antygenu, które syntetyzują IFNγ. Prowadzi to do szybkiego spadku zawartości wirusa we krwi, ale nie do jego zaniku. Odpowiedź komórkowa na zakażenie wirusem HIV polega na tworzeniu specyficznych dla antygenu komórek pomocniczych T CD4+ i komórek T zabójczych CD8+. Cytotoksyczne limfocyty T CD8+ są wykrywane przez cały czas trwania choroby AIDS, z wyjątkiem jej późnych stadiów, podczas gdy limfocyty T CD4+ specyficzne dla wirusa wykrywane są tylko w wczesne stadia choroby. Limfocyty T zabójcze CD8+ zabijają zakażone komórki, zanim wirus opuści komórkę, przerywając w ten sposób replikację wirusa. Istnieje wyraźna odwrotna zależność pomiędzy mianem wirusa w osoczu krwi a liczbą specyficznych limfocytów T CD8+. Zwiększona aktywność proliferacyjna limfocytów T specyficznych dla antygenu CD4+ i CD8+ koreluje z wolniejszym postępem choroby. Dla pacjentów zawierających duża liczba Limfocyty T zabójcze CD8+ charakteryzują się powolnym postępem choroby. Limfocyty T CD4+ odgrywają również ważną rolę w usuwaniu wirusa: istnieje związek pomiędzy odpowiedzią proliferacyjną limfocytów T CD4+ na antygeny HIV a poziomem wirusa w osoczu. Zauważono, że nasilenie wiremii jest ściślej odwrotnie skorelowane z wytwarzaniem IL-2 niż IFNγ. Podczas przewlekłej infekcji wirusowej efektorowe komórki T są ilościowo zachowane, ale zmieniają się funkcjonalnie. Zdolność limfocytów T CD4+ do syntezy IL-2 zmniejsza się; tworzenie cząsteczek cytotoksycznych przez limfocyty T CD8+ jest osłabione. Aktywność proliferacyjna limfocytów T CD8+ zmniejsza się, co uważa się za wynik zmniejszonej produkcji IL-2 przez komórki pomocnicze CD4+. Osłabienie ochrony przeciwwirusowej ułatwia różnicowanie limfocytów T CD4+ w komórki pomocnicze typu Th2. Nawet spektrum cytokin syntetyzowanych przez cytotoksyczne limfocyty T CD8+ charakteryzuje się przewagą cytokin Th2.

To naturalne, że się tego spodziewaliśmy procesy immunologiczne, które choć w osłabionej formie rozwijają się w odpowiedzi na atakującego wirusa, będą w stanie przynajmniej w niewielkim stopniu chronić organizm przed infekcją. W rzeczywistości, jeśli tak się stanie, będzie to tylko możliwe okres początkowy choroby. Następnie, pomimo obecności antygenowo specyficznych limfocytów T CD4+ i CD8+, następuje intensywna replikacja wirusa. Jest to konsekwencja selekcji wirusów z rozpoznanymi zmianami w epitopach

Stany spowodowane zaburzeniem odporność komórkowa(defekt limfocytów T) to ciężkie złożone zespoły niedoboru odporności. U niektórych pacjentów te formy niedoboru odporności mogą powodować ciężkie objawy niebezpieczne choroby(nawet zagrażające życiu), podczas gdy inni mają jedynie drobne problemy zdrowotne. Rozważmy bardziej szczegółowo choroby, które rozwijają się, gdy upośledzona jest odporność komórkowa.

Przewlekła kandydoza skóry i błon śluzowych

Kandydoza (pleśniawka) rozwija się, gdy skóra i błony śluzowe ulegają uszkodzeniu w wyniku infekcji grzybiczej. W rzadkich przypadkach infekcja może rozprzestrzenić się na narządy wewnętrzne.

Predyspozycja do rozwoju kandydozy występuje w przypadku selektywnego niedoboru limfocytów T. Leczenie kandydozy wymaga stosowania specjalnego leki przeciwgrzybicze(niektórzy pacjenci muszą przejść terapię podtrzymującą przez całe życie).

Chondodysplazja przynasadowa

Choroba ta jest autosomalnym recesywnym niedoborem odporności. Powszechne w małżeństwach spokrewnionych. Pacjenci cierpiący na chondrodysplazję przynasadową są szczupli łamliwe włosy i są bardzo podatne na infekcje wirusowe. W niektórych przypadkach chorobę można wyleczyć poprzez przeszczep szpiku kostnego.

Zespół limfoproliferacyjny sprzężony z chromosomem X

Zespół limfoproliferacyjny sprzężony z chromosomem X charakteryzuje się zwiększoną podatnością na wirusa Epsteina-Barra. Wirus Epsteina-Barra może powodować rozwój niebezpiecznych chorób (mononukleoza zakaźna, niedokrwistość aplastyczna, rak węzłów chłonnych, ospa wietrzna, zapalenie naczyń, opryszczka).

Warto zaznaczyć, że choroba ta jest dziedziczona wyłącznie przez mężczyzn.

Zespół IPEX

Zespół IPEX (zaburzenie odporności sprzężone z chromosomem X) może być przyczyną rozwoju różnych chorób autoimmunologicznych (w szczególności cukrzycy), a także przewlekłej biegunki i egzemy. Zespół IPEX dotyka wyłącznie mężczyzn. Leczenie zespołu IPEX polega na podaniu leków immunosupresyjnych, a następnie przeszczepie szpiku kostnego. Wyniki leczenia są zazwyczaj korzystne.

Veno-okluzyjna choroba wątroby

Żylnookluzyjna choroba wątroby jest niezwykle rzadką postacią niedoboru odporności, która jest dziedziczona w sposób autosomalny recesywny z upośledzeniem zarówno limfocytów T, jak i limfocytów B. Pacjenci cierpiący na ten niedobór odporności są predysponowani do rozwoju infekcji grzybiczych. Mogą również mieć niską liczbę płytek krwi i powiększoną wątrobę. Leczenie polega na przeszczepieniu wątroby.

Wrodzona dyskeratoza

Zespół ten powoduje rozwój małogłowia i pancytopenii. Niestety terapia tej choroby jest niezwykle złożona i często nie pozwala pacjentowi na wyleczenie.

Zespół ICF

Zespół ICF (zespół niedoboru odporności, niestabilność centromeru i anomalie twarzy) jest dziedziczony od obojga rodziców z powodu defektów DNA. Pacjenci mają nieprawidłowe rysy twarzy (makroglosję) i zwiększoną podatność na choroby bakteryjne. Możliwą metodą leczenia jest allogeniczny przeszczep komórek macierzystych.

Zespół Nethertona

Zespół Nethertona jest bardzo rzadką chorobą dziedziczoną w sposób autosomalny recesywny. Pacjenci mają prawidłową liczbę komórek T, ale ich liczba komórek B jest zmniejszona. Pacjenci są predysponowani do tej choroby

Autoprzeciwciała przeciwko Harmoninie i Villinie są markerami diagnostycznymi u dzieci z zespołem IPEX
Źródło: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3826762/

Wymyślone i zaprojektowane eksperymenty: V.L. Bosi R.B. Doświadczenia przeprowadził: CL E. Bazzigaluppi CB. Analizowane dane: VL LP FB RB E. Bosi. Stosowane odczynniki/materiały/narzędzia analityczne: LP FB. Napisał artykuł: E. Bosi. Przyczynił się do napisania/edytowania manuskryptu: VL LP FB RB.

Autoprzeciwciała przeciwko antygenom enterocytowym spojówki (białko USH1C o wartości 75 kDa) i kosmkom (białko wiążące aktynę o wartości 95 kDa) są powiązane z zespołem rozregulowania układu odpornościowego, poliendokrynopatia, enteropatia, sprzężona z chromosomem X (IPEX). W tym badaniu ocenialiśmy wartość diagnostyczną autoprzeciwciał harmonicznych i kosmkowych w zespołach IPEX i IPEX-podobnych. Autoprzeciwciała harmoniny i kosmki mierzono za pomocą nowatorskiego testu ilościowego systemu immunoprecypitacji luminescencyjnej (LIPS) u pacjentów z IPEX, zespołem IPEX-podobnym, pierwotnymi niedoborami odporności (PID) z enteropatią, wszystkich zdiagnozowanych na podstawie sekwencjonowania genu FOXP3 i cukrzycą typu 1 (T1D), celiakia i zdrowi dawcy krwi jako grupy kontrolne. Autoprzeciwciała harmoniny i kosmki wykryto odpowiednio u 12 (92%) i 6 (46%) z 13 pacjentów IPEX i u żadnego pacjenta odpowiednio z IPEX, PID, T1D i celiakią. Wszyscy pacjenci IPEX, w tym jeden przypadek z późnym i nietypowym objawem klinicznym, mieli autoprzeciwciała harmoniczne i/lub kosmkowe albo uzyskali dodatni wynik testu na obecność przeciwciał przeciw enterocytom metodą pośredniej immunofluorescencji. Pomiary u pacjentów IPEX w remisji po leczeniu immunosupresyjnym lub przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych wykazały, że autoprzeciwciała harmoniczne i kosmkowe stały się niewykrywalne lub utrzymywały się na niskim poziomie we wszystkich przypadkach, ale w jednym, w którym autoprzeciwciała harmoniczne pozostały stale wysokie. U jednego pacjenta szczyt przeciwciał harmonicznych zbiegał się z fazą nawrotu enteropatii. Nasze badanie pokazuje, że autoprzeciwciała harmoniczne i kosmkowe mierzone za pomocą LIPS są czułymi i swoistymi markerami IPEX, odróżniają IPEX, w tym przypadki atypowe, od innych zaburzeń związanych z enteropatią we wczesnym dzieciństwie i są przydatne w badaniach przesiewowych i monitorowaniu klinicznym chorych dzieci.

Rozregulowanie układu odpornościowego, poliendokrynopatia, enteropatia, zespół sprzężony z chromosomem X (IPEX) to monogenowa choroba autoimmunologiczna charakteryzująca się ciężką enteropatią, cukrzycą typu 1 (T1D) i egzemą. Zespół ten jest spowodowany mutacjami w genie FOXP3 odpowiedzialnym za poważne naruszenie regulatorowe komórki T (Treg). Chociaż metodą z wyboru w celu ostatecznej diagnozy jest analiza genetyczna, nie ma wyraźnej korelacji genotyp-fenotyp, a przebieg choroby jest różny u poszczególnych osób. różni pacjenci. Dodatkowo, pomimo klasyfikacji IPEX jako zespołu niedoboru odporności, nie ma jednoznacznych parametrów immunologicznych, które pozwalałyby przewidzieć ciężkość choroby lub odpowiedź na leczenie. Ponadto zaburzenia o podobnym fenotypie klinicznym, zwane zespołami podobnymi do IPEX, mogą występować przy braku mutacji FOXP3, co stwarza wyzwania dla postępowania klinicznego i selekcji środki lecznicze— . Dlatego identyfikacja markerów specyficznie związanych z dysfunkcją układu odpornościowego IPEX byłaby niezwykle użyteczna do celów diagnostycznych. W przeszłości opisano krążące autoprzeciwciała enterocytów wykrywane za pomocą pośredniej immunofluorescencji w związku z różnymi enteropatiami, w tym tymi ostatecznie zidentyfikowanymi jako zespół IFEX, ale cele molekularne tych markerów serologicznych były od dawna nieznane. Następnie zidentyfikowano odrębny autoantygen enterocytów rozpoznawany przez surowice pacjentów IPEX jako białko AIE-75 o masie 75 kDa i scharakteryzowano je jako białko syndromowe Ushera (USH1C), znane również jako harmoniczne, białko, które według doniesień stanowi część supramolekularnych sieci białek, łączą białka transbłonowe z cytoszkieletem w komórkach fotoreceptorowych i komórkach rzęsatych Ucho wewnętrzne. U pacjentów z IPEX i u niewielkiego odsetka pacjentów z rakiem okrężnicy zgłaszano obecność autoprzeciwciał harmonicznych (HAA) wykrywanych metodą immunoblottingu i radioligandu. Niedawno opisano białko wiążące aktynę, zwane aktyną 95 kDa, zaangażowane w organizację cytoszkieletu aktynowego na granicy szczoteczkowej komórek nabłonkowych, jako dodatkowy cel autoprzeciwciał w podgrupie pacjentów z IPEX. Natomiast, według naszej wiedzy, nie zgłoszono żadnych informacji na temat HAA ani autoprzeciwciał kosmkowych (VAA) w zespołach podobnych do IPEX, pierwotnych niedoborach odporności (PID) z enteropatią lub w zaburzeniach często związanych z IPEX, takich jak T1D i enteropatie autoimmunologiczne różne typy pochodzenie.

Celem pracy było opracowanie ilościowych testów do pomiaru HAA i VAA w oparciu o nowo opracowany Luminescent Immuno Precipitation System (LIPS), określenie ich trafności diagnostycznej w zespołach IPEX, IPEX-podobnych i PID, ocena ich na podstawie przeciwciał enterocytowych badanych metodą immunofluorescencji i ocenić ich wartość w obserwacji klinicznej pacjentów IPEX.

Trzynastu pacjentów z IPEX i 14 pacjentów z zespołem podobnym do IPEX zostało przebadanych w LIPS na obecność HAA i VAA. Jako grupę kontrolną przebadaliśmy 5 pacjentów z PID różnego pochodzenia [dwóch z niedoborem CD25, dwóch z zespołem Wiskotta Aldricha (WAS)] i jednego z niedoborem deaminazy adenozyny – ciężkim złożonym niedoborem odporności (ADA-SCID), przy czym wszystkie schorzenia charakteryzowały się wczesnym początkiem enteropatia], 123 z T1D, 70 z celiakią i 123 zdrowych dawców krwi. Rozpoznanie IPEX oparto na wynikach klinicznych i molekularnych zgodnie z kryteriami ustalonymi przez Włoskie Stowarzyszenie Hematologii i Onkologii Dziecięcej (AIEOP, www.AIEOP.org). Mutacje i dane kliniczne pacjentów IPEX i IPEX podsumowano odpowiednio w tabelach S1 i S2. Wszyscy pacjenci IPEX z wyjątkiem Pt19, Pt21, Pt22 i Pt24 zostali opisani w poprzednich publikacjach. PT24 jest atypową postacią choroby charakteryzującą się późnym początkiem, bez cech enteropatii, ale z ciężkim zapaleniem błony śluzowej żołądka z obecnością nacieków zapalnych błony śluzowej związanych z zanikiem kosmków. Całkowite poziomy IgG były dostępne u 10 z 13 badanych pacjentów IPEX: spośród nich 8 mieściło się w zakresie prawidłowym dla wieku (tylko jeden pacjent otrzymywał dożylną (IV) terapię Ig), podczas gdy w dwóch przypadkach były nieznacznie podwyższone. Pacjenci, u których zdiagnozowano zespół podobny do IPEX, mieli objawy kliniczne IPEX, ale zostali przebadani wynik negatywny dla mutacji w genie FOXP3. U pacjentów podobnych do IPEX występowała co najmniej jedna z głównych cech klinicznych IPEX (enteropatia autoimmunologiczna i/lub T1D) związana z jedną lub większą liczbą następujących chorób autoimmunologicznych lub o podłożu immunologicznym: zapalenie skóry, zapalenie tarczycy, niedokrwistość hemolityczna, małopłytkowość, nefropatia, zapalenie wątroby , łysienie, hiper-IgE z eozynofilią lub bez. Parametry kliniczne i laboratoryjne wykluczyły inne choroby monogenowe, takie jak WAS, zespół Omenna, zespół hiper-IgE i autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny. W momencie postawienia diagnozy dostępna była co najmniej jedna próbka surowicy od pacjentów z zespołami IPEX i IPEX-podobnymi do badania autoprzeciwciał. Od sześciu pacjentów IPEX pobrano także wiele próbek surowicy w trakcie obserwacji klinicznej i wykorzystano je do dodatkowych pomiarów autoprzeciwciał w celu zbadania korelacji z wynikami klinicznymi (próbki Pt12:8 od urodzenia do 8 lat, próbki Pt14:7 od 6 miesięcy do 13 lat, próbki Pt17-3, od 4 miesięcy do 3,5 roku, próbki Pt19:44 od 4 miesięcy do 2 lat, próbki Pt22:3 od 0 do 5 miesięcy, Pt 23:44 od 4 do 10 lat). U wszystkich pacjentów z PID diagnozowano na podstawie badań molekularnych. Wszyscy pacjenci z T1D byli przypadkami niedawnymi, a ich diagnoza opierała się na kryteriach Amerykańskiego Stowarzyszenia Diabetologicznego; pacjentów z celiakią badano w momencie rozpoznania na podstawie biochemii jelita czczego.

Zgodnie z oświadczeniem z Helsinek każdemu pacjentowi i jego najbliższemu krewnemu, opiekunowi lub opiekunowi w imieniu nieletnich/dzieci uczestniczących w tym badaniu udzielono pisemnej świadomej zgody. Badanie zostało zatwierdzone przez lokalną komisję ds. etyki badań naukowych w San Raffaele.

Wszystkich pacjentów sklasyfikowanych jako mających zespół IPEX lub podobny do IPEX włączono do badania pod kątem mutacji FOXP3. Wyizolowano genomowy DNA krew obwodowa stosując metodę fenolowo-chloroformową lub zestaw QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcją producenta. Jedenaście egzonów, w tym wszystkie granice intron-ekson, amplifikowano z genomowego DNA metodą PCR ze specyficznymi flankującymi parami starterów intronowych. Amplifikowane fragmenty genów sekwencjonowano przy użyciu zestawu cyklicznego BigDye Terminator (Applied Biosystems) na automatycznym analizatorze genetycznym ABI PRISM 3130xl i analizatorze genetycznym ABIPRISM 3730 (Applied Biosystems).

Sekwencję kodującą lucyferazę Renilla sklonowano do plazmidu pTnT (Promega, Mediolan, Włochy) w celu wygenerowania wektora pTnT-Rluc. Sekwencje kodujące DNA harmoniczne i kosmków pełnej długości amplifikowano następnie metodą RT-PCR i klonowano oddzielnie do pTnT-Rluc poniżej i w ramce odczytu z lumiferazą Renilla. Rekombinowane chimeryczne Rluc-Harmonin i Rluc-Villin wyrażano poprzez sprzężoną transkrypcję i translację in vitro przy użyciu systemu komórkowego wolnego od lizatu retikulocytów króliczych pTnT-quick SPM (Promega). Aby przetestować obecność HAA lub VAA, Rluc-Harmonin i Rluc-Villin zastosowano jako antygeny w LIPS (17) poprzez inkubację 4 × 106 jednostek światła równoważnych z 1 μl surowicy każdego pacjenta w PBS pH 7,4-Tween 0,1% ( PBST) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, kompleksy immunologiczne IgG wyizolowano przez dodanie białka A-Sepharose (GE Healthcare, Mediolan, Włochy), a następnie inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 4°C i przemycie niezwiązanym Ag PBST przez filtrację w 96- oraz płytki filtracyjne Costar 3504 (Corning Life Sciences, Tewksbury, USA). Następnie oznaczono ilościowo antygeny poddane immunoprecypitacji, mierząc odzyskaną aktywność lucyferazy po dodaniu substratu lumiferazy Renilla (Promega) i mierząc emisję światła przez 2 sekundy w luminometrze Centro XS3 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG, Bad Wildbad, Niemcy). Wyniki wyrażono w jednostkach arbitralnych, wyprowadzonych albo ze wskaźnika przeciwciał (BAA), przy użyciu surowic dodatnich i ujemnych zgodnie ze wzorem (surowica kontrolna cps – surowica ujemna cps) / (surowica dodatnia cps – surowica ujemna pod względem cps) x100 lub z krzywa standardowa (HAA), składająca się z seryjnych rozcieńczeń wyjściowej surowicy dodatniej. Punkt odcięcia wyniku dodatniego ustalono na 99. percentylu wartości obserwowanych u zdrowych dawców krwi, zgodnie z powszechną praktyką w warsztatach autoprzeciwciał wrażliwych na T1D, analizujących czułość i swoistość.

Autoprzeciwciała enterocytów oznaczono w grupach pacjentów IPEX i IPEX-podobnych za pomocą pośredniej immunofluorescencji na skrawkach kriostatu prawidłowego ludzkiego lub małpiego jelita czczego, jak opisano wcześniej.

Markery autoprzeciwciał T1D i celiakii, w tym przeciwciała dekarboksylazy kwasu glutaminowego (GADA), białko związane z insulinoma 2, insulina, transporter cynku 8 i transglutaminaza-C, mierzono u wszystkich pacjentów IPEX, IPEX-podobnych, PID, T1D, celiakii, i zdrowe kontrole, grupy kontrolne dawców metodą immunoprecypitacji przy użyciu LIPS lub soczewki radioaktywnej, jak opisano wcześniej. Wszystkie wyniki wyrażono w jednostkach arbitralnych pochodzących z krzywych standardowych uzyskanych przez seryjne rozcieńczenia dodatnich surowic podstawowych.

W badaniu tym wykorzystano wyłącznie statystyki opisowe. Obliczenia 99. percentyla losowych jednostek u dawców krwi w celu selekcji progowej przeprowadzono przy użyciu Stata (StataCorp LP, USA). Warunkowe prawdopodobieństwo pozytywnego (czułość) lub negatywnego (swoistość) testu na obecność HAA lub VAA w funkcji obecności lub braku choroby IPEX i powiązanych 95% przedziałów ufności obliczono za pomocą strony internetowej Vassar Stats do obliczeń statystycznych (http: //vassarstats.net/clin1.html). Korelację między mianami HAA i VAA oparto na testach korelacji rang Spearmana i obliczono za pomocą oprogramowanie Graphpad Pryzmat 5.

Podwyższone stężenia krążącego HAA stwierdzono u 12 z 13 (92%) pacjentów z IPEX, podczas gdy były one ujemne u pacjentów z IPEX, PID, T1D i celiakią (ryc. 1A). Podwyższone stężenia krążących VAA stwierdzono u 6 (46%) pacjentów IPEX (Pt19, Pt14, Pt12, Pt17, Pt3, Pt21, przy czym u czterech ostatnich miano było równe lub większe niż 98 VAA AU), w tym u pacjenta bez HAA ( Pt17), a następnie jak VAA były negatywne w grupach kontrolnych typu IPEX i innych grupach kontrolnych choroby (ryc. 1B). Wszyscy pacjenci z IPEX byli dodatni pod względem HAA lub VAA, co dało czułość testu kombinacji HAA i VAA 100% (95% CI: 71,6 do 100%) i swoistość testu 97,6% (95% CI: 92,5 do 99,4%) ) do diagnozowania zespołu IPEX. Brak cech klinicznych lub fenotypowych korelujących z obecnością któregokolwiek z autoprzeciwciał u pacjentów z IPEX. U pacjentów IPEX nie zaobserwowano istotnej korelacji pomiędzy tytanami autoprzeciwciał AAA i VAA (Spearman r = -0,3 p = ns). GADA, jako najczęstsze autoprzeciwciała przeciwko T1D, stwierdzono u pacjentów z IPEX (9 z 13, 5 z T1D), zespołem typu IPEX (4 z 14, 2 z T1D) i PID (3 z 5, 1 z T1D) ( Ryc. 1C). Inne autoprzeciwciała T1D wykryto w mniejszych proporcjach, w tym autoprzeciwciała insulinowe u 5 autoprzeciwciał IPEX, 4 IPEX-podobnych i 2 PID oraz autoprzeciwciała Zinc Transporter 8 u jednego pacjenta IPEX. Nie stwierdzono korelacji pomiędzy mianami GADA i HAA lub VAA (odpowiednio Spearman r = -0,017 p = ns i r = 0,34 p = ns). Żaden z pacjentów z IPEX, zespołem IPEX-podobnym lub PID nie miał związanych z celiakią autoprzeciwciał przeciwko transglutaminazie C tkankowej IgA lub IgG (dane nie pokazane).

Miana przeciwciał IgG w surowicy HAA (panel A), VAA (panel B) i GADA (panel C) wyrażone w jednostkach arbitralnych w IPEX (n = 13), IPEX-podobne (n = 14), PID (n = 5), T1D ( VAA i GADA n = 123, VAA n = 46), chorzy na celiakię (HAA n = 70, VAA n = 46, GADA n = 44) oraz osoby z grupy kontrolnej (HAA i VAA n = 123, GADA n = 67). Linia przerywana wskazuje granicę wartości dodatniej.

Wszystkie surowice IPEX, z wyjątkiem jednej (Pt 22), 10 surowic podobnych do IPEX i 3 surowice PID, zbadano pod kątem przeciwciał enterocytowych metodą immunofluorescencji na skrawkach kriostatu jelitowego. U wszystkich przebadanych pacjentów IPEX wynik był pozytywny na obecność przeciwciał przeciwko enterocytom. Surowice HAA-dodatnie wykazywały silną reaktywność wobec enterocytów jelitowych i cytozolu, z największą intensywnością na brzegu szczoteczki (ryc. 2A). Wyizolowany VAA o wysokim mianie wykazywał silne wybarwienie w celu oczyszczenia granicy, ale nie cytozolu (ryc. 2B). Poza grupą pacjentów IPEX tylko jedna surowica od pacjenta z zakażeniem PID z mutacją genu CD25 i negatywną pod względem HAA i VAA (Pt L1) wykazała dodatnie barwienie enterocytów ograniczone do brzegu dłoni (ryc. 2C).

HAA z IPEX Pt 19 wiąże brzeg szczoteczkowy i cytozol enterocytów (panel A), natomiast VAA z IPEX Pt 17 wiąże tylko brzeg szczoteczkowy (panel B). IgG z PID Pt L1 wiąże się z rąbkiem szczoteczkowym enterocytów (panel C). Brak wiązania w Pt L30 typu IPEX (panel D).

Kolejne próbki do pomiarów HAA i VAA były dostępne od 6 pacjentów IPEX (Pt12, Pt14, Pt17, Pt19, Pt22 i Pt23): wszyscy przeszli przeszczep hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT) w ramach terapię terapeutyczną w 4 przypadkach poprzedzony zmiennym okresem immunosupresji ogólnoustrojowej. W momencie sporządzania tego raportu (kwiecień 2013 r.) wszyscy pacjenci z przeszczepieniem z wyjątkiem dwóch żyli, byli w remisji klinicznej z powodu enteropatii i nie byli poddawani terapii immunosupresyjnej (Tabela S1). Analiza genetyczna Krew obwodowa pobrana po przeszczepieniu wykazała 100% chimeryzm dawcy w 4 przypadkach (Pt12, Pt14, Pt19 i Pt22), a u pozostałych pacjentów mieszany chimeryzm dawca/biorca. Na początku enteropatii u trzech pacjentów występowało zarówno HAA, jak i VAA (Pt12, Pt14 i Pt19), u jednego tylko VAA (Pt17), a u dwóch tylko HAA (Pt22 i Pt23) (ryc. 3). W pięciu przypadkach (Pt12, Pt14, Pt17, Pt22 i Pt23) remisji klinicznej lub znacznej poprawie po immunosupresji lub HSCT towarzyszyło zmniejszenie mian zarówno HAA, jak i/lub VAA, które stało się niewykrywalne lub utrzymywało się przy bardzo niskich mianach w czterech przypadkach. przypadki z najdłuższą obserwacją. W jednym przypadku (Pt19) po HSCT VAA stało się niewykrywalne, podczas gdy HAA utrzymywało się na wysokim poziomie pomimo remisji klinicznej (ryc. 3D). W co najmniej jednym przypadku (Pt14) stwierdzono, że HAA jest czułym markerem enteropatii: HAA wykryto w wysokich stężeniach w związku z ciężką enteropatią w momencie rozpoznania IPEX, a następnie obniżono podczas remisji klinicznej i histologicznej po leczeniu immunosupresyjnym, osiągając szczyt podczas nawrotu klinicznego, a następnie stał się trwale niewykrywalny po udanym HSCT i remisji klinicznej (ryc. 3B). Chociaż VAA jest mniej rozpowszechniony, wykazuje wzór podobny do HAA. Spadek liczby autoprzeciwciał obserwowany po HSCT był spowodowany niedoborem limfocytów B i IgG wtórnym do kondycjonowania. Rzeczywiście, z wyjątkiem Pt22, który miał krótki przeszczep pooperacyjny, wszyscy pacjenci ze zmniejszonym mianem HAA lub VAA po HSCT (Pt12, 17 i 23) byli już zaszczepieni, a terapia IVIg była niezależna w momencie pierwszego badania po HSCT .

Oś pionowa pokazuje HAA (romby) i VAA (trójkąty), miana autoprzeciwciał wyrażone w dowolnych jednostkach, w czasie pozioma oś w ciągu miesięcy. Pionowa linia przerywana wskazuje datę HSCT, pozioma linia przerywana i kropkowana wskazują granicę odpowiednio dla dodatniego wyniku HAA i VAA.

W tym badaniu wykazaliśmy, że HAA i VAA, które można łatwo zmierzyć za pomocą nowych testów LIPS i zastosować w połączeniu, są bardzo czułymi i swoistymi markerami zespołu IPEX i mogą go przewidzieć wynik kliniczny. W rzeczywistości wszyscy pacjenci IPEX z diagnozą potwierdzoną badaniami genetycznymi mieli podwyższone stężenia HAA lub VAA. Natomiast żaden z pacjentów z enteropatią bez mutacji FOXP3 (np. typu IPEX lub PID), pacjentów z T1D lub celiakią nie był dodatni w kierunku HAA ani VAA. Spośród dwóch markerów najwyższą czułość wykazał HAA, który stwierdzono u 12 z 13 pacjentów IPEX, podczas gdy VAA wykryto tylko u sześciu z nich. Warto zauważyć, że HAA i VAA okazały się cennymi markerami zespołu IPEX również w nietypowe przypadki, takie jak Pt24, gdzie enteropatia nie była częścią obrazu klinicznego, lecz zamiast tego dominowała ciężkie zapalenie błony śluzowej żołądka, w którym podejrzewano IPEX, a następnie potwierdzono to przez sekwencjonowanie genu FOXP3 dopiero po wykryciu podwyższonego poziomu HAA. W przyszłości nowy test LIPS umożliwi bardziej systematyczne badania przesiewowe w kierunku HAA i VAA u pacjentów z heterogennymi zespołami klinicznymi, z możliwością identyfikacji więcej przypadków klinicznie nietypowych zespołów IPEX.

GADA były drugą po HAA najczęstszą reakcją autoprzeciwciał obserwowaną u pacjentów IPEX. Chociaż GADA są najczęstszym markerem autoprzeciwciał T1D i charakteryzują się szerokim zakresem mian na początku choroby, nie zawsze są one związane z cukrzycą. W rzeczywistości można je znaleźć w innych choroby autoimmunologiczne, w tym zespół sztywnego człowieka i poliendokrynopatia autoimmunologiczna (APS). Co ciekawe, u pacjentów z AFP GADA jest bardziej skorelowana z rozwojem objawów żołądkowo-jelitowych niż z cukrzycą. Co ciekawe, również u naszych pacjentów IPEX GADA występowały w dużej mierze często, ale nie były konsekwentnie powiązane z T1D.

Oprócz tego, że są dokładnymi markerami zespołu IPEX, HAA i VAA mogą mieć potencjalną wartość prognostyczną, zwłaszcza w odniesieniu do towarzyszącej enteropatii. Sześciu pacjentów z dostępnymi próbkami po prowokacji miało wysokie miana zarówno HAA, jak i VAA w momencie rozpoznania lub na początku objawów żołądkowo-jelitowych i przed leczeniem. Następnie w pięciu przypadkach po leczeniu immunosupresyjnym i/lub HSCT (Pt12, Pt14, Pt17, Pt22 i Pt23) miana HAA i VAA spadły do ​​niewykrywalnych lub pozostały na niskim poziomie w pobliżu progu wykrywalności, odzwierciedlając kliniczną i histologiczną remisję choroby powiązana enteropatia. W jednym z nich (Pt14) przejściowemu nawrotowi enteropatii występującemu w trakcie leczenia immunosupresyjnego towarzyszył szczyt HAA, a następnie spadek po remisji klinicznej. Niestety u tego pacjenta brak próbek seryjnych uniemożliwił udokumentowanie czasu wzrostu autoprzeciwciał poprzedzającego nawrót enteropatii. W jednym przypadku (Pt19) remisji klinicznej towarzyszył spadek VAA, ale nie HAA, który utrzymywał się przy wysokich mianach do 15 miesięcy po HSCT. Stwierdzenie zmniejszonych mian HAA i VAA po HSCT u większości, ale nie u wszystkich pacjentów, jest niezwykle intrygujące i prawdopodobnie związane z przeżyciem pozostałych limfocytów gospodarza lub komórek plazmatycznych odpowiedzialnych za trwałą produkcję tych autoprzeciwciał.

Wprowadzenie tych markerów autoprzeciwciał do praktyki klinicznej byłoby stosunkowo proste, biorąc pod uwagę łatwość ich pomiaru za pomocą niedawno opracowanego LIPS. Niedawno zaproponowano tę technologię jako nową, nieradioaktywną procedurę mającą na celu zastąpienie radioaktywnego przeciwciała i immunoprecypitującego białka A w złoty standard rekombinowanych antygenów ludzkich znakowanych 35S-metioniną transkrybowanych in vitro i znakowanych 35S-metioniną, zweryfikowanych w ramach ustalonych programów standaryzacji autoprzeciwciał zarówno w leczeniu T1D, jak i T1D. nietolerancja glutenu. W ostatnich raportach LIPS wykazał skuteczność porównywalną z testami łącza radiowego i wyższą niż wcześniej istniejący test ELISA. W tym badaniu LIPS opracowano przy użyciu rekombinowanej chimerycznej lumiferazy Renilla (Rluc)-Harmonin i Rluc-Villin jako antygenów, w wyniku czego uzyskano test z niskim szumem tła i liniowymi ilościowymi pomiarami autoprzeciwciał umożliwiającymi rozróżnienie pozytywne rezultaty z ujemnych próbek surowicy. Podsumowując, pomiar HAA i VAA przy użyciu LIPS okazał się szybkim, prostym i powtarzalnym testem, który można łatwo zastosować w praktyce klinicznej.

Co ciekawe, to samo wskaźniki diagnostyczne połączone HAA i VAA obserwowano z autoprzeciwciałami enterocytów wykrywanymi metodą tradycyjnej pośredniej immunofluorescencji. Nie jest również jasne, ale warto przetestować w przyszłości, czy harmoniczne i kosmki są jedynymi antygenami rozpoznawanymi na enterocytach przez autoprzeciwciała związane z IPEX, czy też nie zidentyfikowano jeszcze innych celów autoantygenów enterocytów dla przeciwciał związanych z IPEX.

Do tej pory IPEX uznawano za chorobę immunologiczną specyficzną dla limfocytów T, wynikającą z dysfunkcji komórek Treg, z ograniczoną uwagą na powiązane defekty humoralnej odpowiedzi odpornościowej: nasze wyniki podkreślają powiązanie głównych mutacji genu FOXP3 z solidną i wymierną odpowiedzią antygenowo-specyficzną autoprzeciwciało. Jednakże, ponieważ komórki B nie wyrażają FOXP3, jest mało prawdopodobne, aby mutacje FOXP3 miały bezpośredni wpływ na rozwój komórek B i/lub produkcję przeciwciał. Jednakże ostatnie badania wskazują, że komórki B mogą być zarówno bezpośrednim, jak i pośrednim celem funkcji supresyjnej, w której pośredniczą komórki Treg, a zmiany w komórkach Treg wpływają na miano autoprzeciwciał zarówno w modelach mysich, jak i u ludzi. Co więcej, bezpośrednie dowody uzyskane od myszy z mutacją foxp3 wskazują, że brak limfocytów Treg wiąże się z nieprawidłowym rozwojem limfocytów B, utratą alergicznych limfocytów B i rozwojem długowiecznych komórek plazmatycznych. Ponadto niedawno wykazano, że u ludzi niedobór FOXP3 powoduje akumulację autoreaktywnych klonów w przedziale dojrzałych naiwnych komórek B, co sugeruje ważną rolę komórek Treg w kontroli punktów kontrolnych z perspektywy obwodowych komórek B.

Mechanizmy odpowiedzialne za autoimmunizację hormonalną i kosmkową w IPEX oraz rola tych autoantygenów w patologicznych objawach zespołu IPEX pozostają nieznane. Harmonina ulega ekspresji w kilku tkankach, w tym w jelicie cienkim, okrężnicy, nerkach, oku, przedsionku ucha wewnętrznego i, słabo, trzustce. W jelicie ekspresja harmonizatora występuje głównie w komórkach nabłonka powierzchni światła oraz w górnej połowie krypt jelitowych i jest prawdopodobnie zlokalizowana w mikrokosmkach dłoni; podobną lokalizację wykazano dla kosmków. Biorąc pod uwagę, że główną cechą histopatologiczną enteropatii IPEX jest zanik kosmków z apoptotyczną śmiercią komórek nabłonka jelitowego w połączeniu z umiarkowanym do ciężkiego stanem zapalnym, jest prawdopodobne, że w tym kontekście harmonijka ustna i tkanka kosmkowa mogą działać jako istotne cele molekularne patogennej autoimmunizacji.

Badanie to wykazało, że HAA i VAA mierzone za pomocą LIPS są dokładnymi markerami diagnostycznymi zespołu IPEX, ze 100% zgodnością mutacji genu FOXP3, które różnicują IPEX, w tym przypadki atypowe, od innych zaburzeń związanych z enteropatią dziecięcą. Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że w procesie diagnostycznym należy uwzględnić HAA i VAA obserwacja kliniczna monitorowanie pacjentów z zespołem IPEX, u których zmiany w mianach HAA i VAA sugerujące nawracającą enteropatię mogą pomóc klinicystom w podjęciu szybkich decyzji terapeutycznych.

Cechy kliniczne pacjentów IPEX.

Cechy kliniczne pacjentów typu IPEX.

Kliknij tutaj po więcej informacji.

Autorzy są wdzięczni swoim kolegom, którzy uprzejmie udostępnili próbki surowicy i informacje kliniczne na temat pacjentów IPEX i IPEX: E. S. Kangowi i Y. H. Choe, Seul, Republika Korei; G. Zuin, Mediolan, Włochy; A. Staiano, R. Troncone i V. Discepolo, Neapol, Włochy; J. Schmidtko, Berno, Szwajcaria; A. IkinciogullariZ. SedaUyan, M. Aydogan, EO Tzu, Ankara, Türkiye; G.R. Corazza i R. Ciccocioppo, Pawia, Włochy; S. Vignola, Genua, Włochy; A. Bilbao i S. Sanchez-Ramon, Madryt, Hiszpania; J. Reichenbachand M. Hoernes, Zurych, Szwajcaria; M. Abinun i M. Slatter, Newcastle upon Tyne, Wielka Brytania; M. Cipolli, Werona, Włochy; F. Guracan, Ankara, Turcja; F. Locatelli i B. Lucarelli, Rzym, Włochy; C. Cancrini i S. Corrente, Rzym, Włochy; A. Tommasini, Triest, Włochy; L. Guidi, Rzym, Włochy; E. Richmond Padilla i O. Porras, San Jose, Kostaryka; S. Martino i D. Montin, Turyn, Włochy; M. Hauschild, Niemcy; K. Nadeau i M. Butte, Stanford, Kalifornia; A. Aiuti, G. Barera, F. Meschi i R. Bonfanti, Mediolan, Włochy. Autorzy dziękują także: M. Cecconi i D. Coviello za genotypowanie FOXP3; oraz członkom włoskiej grupy badawczej IPEX (www.ipexconsortium.org) R. Badolato, M. Cecconi, G. Colarusso, D. Coviello, E. Gambinera i A. Tommasini za wsparcie i zachętę. Autorzy dziękują pacjentom i ich rodzinom za zaufanie i udział w naszych badaniach.